פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר את הדור של אורגנואידים האשכים, אשר יכול לשמש כפלטפורמה לחקר morphogenesis האשך עבור תרופות tropo גבוהה הקרנות רעילות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת לשחזור מאוד, דורשת מספר נמוך יחסית של תאים ו ניתן להשתמש בה כדי ליצור מספר רב של אורגנואידים האשכים עם ארכיטקטורה ספציפית לאשם. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מערכות אחרות, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים או תאי איון הלבלב עם האופטימיזציה הדרושה.
הפגנת הליך העיכול האנזימטי של רקמת האשכים תהיה אנה וויגט, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. אסוף את האשכים לתוך מקור סטרילי ולשטוף עם PBS המכיל 1%פניצילין סטרפטומיצין. לאחר הכביסה מעבירים את האשכים לתבשיל תרבות רקמה של 100 מילימטר עם PBS המכיל 1%פניצילין סטרפטומיצין.
השתמש מספריים autoclaved ומלקחים כדי להסיר את הנרתיק טוניקה ואפידימיס. מעבירים את האשכים המבודדים לתבשיל חדש של 100 מילימטרים ושוטפים היטב עם PBS המכיל 1%פניצילין סטרפטומיצין. חותכים את האשכים לאורך ציר האורך ישירות מתחת לטוניקה.
לאחר מכן לקלף את האשכים מתוך טוניקה באמצעות שני ממטרים ולמקם אותו לתוך צלחת חדשה 100 מילימטר המכיל 1 מיליליטר של DMEM עם 1% פניצילין סטרפטומיצין. טחון את האשכים קלופים עם מספריים סטריליים לחתיכות רקמה אחד עד שני מילימטר. לאחר החיתוך להשתמש מדפים סטריליים כדי להסיר את השברים הלבנים של רקמת חיבור.
להעביר את חתיכות רקמה טחון לתוך פתרון A בצינור 50 מיליליטר ו לראשו עד 50 מיליליטר עם DMEM כדי לקבל ריכוז של 0.4 מיליגרם למיליליטר עבור colagenase 4S וריכוז של 0.8 מיליגרם למיליליטר עבור colagenase 4W. מניחים את הצינור המכיל את חתיכות הרקמה לתוך 37 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך 30 דקות. בעדינות להפוך את הצינור כל חמש דקות.
לאחר 30 דקות, צנטריפוגה הצינור ב 90 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות. השלך את supernatant, מודעה 40 מיליליטר של פתרון B, ו העליון עד 50 מיליליטר עם DMEM כדי לקבל ריכוז של 1.2 מיליגרם למיליליטר של colagenase 4W. מניחים את הצינור לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בעדינות להפוך את הצינור כל חמש דקות.
צנטריפוגה הצינור ב 90 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות. לאחר מכן להשליך את supernatant, ולשטוף פעם אחת עם PBS עם 1%פניצילין סטרפטומיצין. בזהירות לאסוף את הצינורות מלמעלה ואת המקום לתוך צינור חדש 50 מיליליטר.
למעלה את הצינור עם PBS עד 50 מיליליטר. צנטריפוגה הפקעות ב 90 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות. השליכו את העל-טבעי והוסיפו PBS טרי לשטוף פעמיים נוספות.
לאחר לשטוף PBS האחרון להסיר את העל טבעי מחדש להשעות את צינוריות חצי מיליליטר בחמישה מיליליטר של PBS. לאחר מכן, להוסיף 15 מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לשחפת. מניחים את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס בעדינות להפוך כל שתי דקות.
לאחר חמש דקות להעריך את העיכול האנזימטי של צינוריות לתאים בודדים מתחת למיקרוסקופ עם 10 microliters של מדגם על צלחת תרבות רקמה. כל שתי דקות מניחים את הדגימה מתחת למיקרוסקופ כדי להתבונן. אם בעיקר תאים בודדים ניתן לזהות לעצור את התגובה עם חמישה מיליליטר של FBS ולסנן דרך רשת של 70 מיקרון ולאחר מכן דרך רשת של 40 מיקרון.
צנטריפוגה התאים הבודדים ב 500 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. להשעות מחדש 50 מיליליטר של מדיום העשרה, ולספר את מספר התאים קיימא באמצעות hemocytometer. העבר 20 מיליון מאוכלוסיית תאים התחלתית זו לכל אחד משני צלחות פטרי אולטרה-נמוכות 100 מילימטר וחרבן באינקובטור של תרבות הרקמות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ו-21% חמצן ליומיים.
לוותר על 20 עד 25 מיליון תאים של אוכלוסיית התאים ההתחלתיים הנותרים לכל צלחת תירתי רקמה 100 מילימטר בנפח כולל של שמונה מיליליטר של מדיום העשרה. מניחים את המנה לתוך אינקובטור ולאחר 1.5 שעות להבטיח כי רוב התאים Sertoli מחוברים לצלחת. להטות מעט שתי צלחות כדי לאסוף ולשלב את supernatants לתוך צלחת אחת חדשה 100 מילימטר ולמקום אותו בחזרה לתוך החממה.
לאחר שעה, שוב לשלב את supernatants של שתי צלחות לצלחת חדשה 100 מילימטר. מניחים את הצלחות בחזרה לתוך החממה לילה. לאחר מכן לאסוף את תאי הנבט מועשר בשני שברים, שבר שאינו חסיד שבר חסידי מעט.
אסוף את העל-טבעי כשבר שאינו חסיד. עבור שבר מעט חסיד לשטוף את הצלחות בעדינות עם PBS ולטפל עם שני מיליליטר של אחד עד 20 דילול של 0.25% טריפסין EDTA במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לעצור את התגובה על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיום העשרה ולאסוף בצינור שבר שאינו חסיד.
שלב את הכנת התא ההתחלתי ואת תאי הנבט המועשרים בצינור כדי להשיג הכנת תא עבודה המכילה 25% תאי נבט. צנטריפוגה ב 500 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב-20 מיליליטר של מדיום היווצרות אורגנואידים כדי להגיע לריכוז של 2.4 מיליון תאים למיליליטר.
בצינור חדש להוסיף מיליליטר אחד של הפתרון המכיל תאים. הוסף 0.5 מיליליטר של פתרון שטיפה פעילי שטח לכל באר בצלחת מיקרו באר. ודא כי אין בועות אוויר לכודים באר.
כדי להסיר בועות אוויר צנטריפוגה הצלחת ב 2, 000 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. שימו לב לצלחת תחת מיקרוסקופ הפוך הגדלה נמוכה כדי לוודא שהבועות הוסרו מהמיקרו בארות. מכסים את הצלחת במכסה ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר סיום הטיפול להסיר את פתרון השטיפה מיד לשטוף את הצלחת עם מים סטריליים או PBS. הוסף 0.5 מיליליטר של היווצרות אורגנואידית בינונית לכל באר וצנטריפוגה ב 2, 000 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי להסיר את כל בועות אוויר לכודים. שימו לב ל באר תחת מיקרוסקופ הפוך הגדלה נמוכה כדי לוודא כי בועות האוויר הוסרו.
מוסיפים 0.5 מיליליטר של ההשעיה של תא העבודה ומערבבים בעדינות על ידי צינור למעלה ולמטה. צנטריפוגה ב 500 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהתאים התקבצו בתוך בארות המיקרו.
מעבירים את הצלחת לאנקובטור ותרבות של תרבות תאים למשך חמישה ימים. תחליף חצי מהמדיום כל יומיים. כדי לשחזר את האורגנואידים להשתמש פיפטה רחבת פה כדי pipette בעדינות את המדיום למעלה ולמטה.
זה מאפשר האורגנואידים לצאת ממיקרו בארות. לאסוף את האורגנואידים, לתקן ולבצע ציטוכימיה חיסונית עבור סמן תא נבט, סמן תא Sertoli, סמן תא מיואיד פריטובולרי סמן תא Leydig ולהמחיש תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. במחקר זה בודדו תאים מתוך אשכי פורצ'ין בני שבוע שהיו מתורבתים במיקרו בארות מאורגנות בעצמן לספריואידים עם תאים חיצוניים ופנימיים מובחנים ומובחנים.
שני התאים הופרדו על ידי קרום מרתף חיובי קולגן IV. תאי סרטולי חיוביים GATA4 ותאי נבט חיוביים UCHL1 היו בתא החיצוני על קרום המרתף. תאי מיואידים פרי-צינוריים חיוביים של aSMA היו מקומיים לאורך החלק הפנימי של קרום המרתף בעוד תאי Leydig חיוביים CYP450 היו במרכז האינטרסטיטיום.
מבנה זה דומה לתנאי Situ, שבו תאי Leydig, תאים מיואידים צינוריים פרי, ממוקמים interstitium, בתאי תאים interstitial ונבט, תאי Sertoli ממוקמים האפיתל חצי שנתי. חשוב להבטיח כי תאים המשמשים ליצירת אורגנואידים יש איכות אופטימלית. יש להקדיש תשומת לב זהירה במהלך שלב ההתזה של העיכול האנזימטי.
בעקבות הליך זה האורגנואידים יכולים להיות מתורבתים לטווח ארוך כדי ללמוד התברואה תא נבט או לנתח ביטוי גנים וחלבונים מופרשים או הורמונים. היכולת ליצור אורגנואידים עם אסוציאציות תאים ספציפיות לאשם מספקת מערכת חוץ-חוץ-תאית חדשנית לחקר אינטראקציות בין תאים לתאים החשובים להתפתחות האשכים ולתפקוד תאי הנבט.
