Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет генерации органоидов яичка, которые могут быть использованы в качестве платформы для изучения морфогенеза яичка и для высоких tropo наркотиков и токсичности скринингов. Основным преимуществом этой техники является то, что она очень воспроизводится, требует относительно небольшого количества клеток и может быть использована для создания большого количества органоидов яичек с конкретной архитектурой яичка. Этот метод может быть применен для изучения других систем, таких как плюрипотентные стволовые клетки или островков поджелудочной железы с необходимой оптимизацией.
Демонстрацией процедуры энзиматической пищеварения ткани яичка будет Анна Фойгт, аспирантка из моей лаборатории. Соберите яички в стерильный стакан и мыть с PBS, содержащий 1%пенициллин стрептомицин. После мытья перенесите яички на 100-миллиметровую культурную тарелку с PBS, содержащую 1%пенициллин стрептомицин.
Используйте автоматические ножницы и типсы, чтобы удалить туника vaginalis и epididymis. Перенесите изолированный яички в новое 100-миллиметровое блюдо и тщательно промойте PBS, содержащим 1%пенициллин стрептомицин. Вырезать яичка вдоль продольной оси прямо под туника.
Затем очистить яички из туники с помощью двух типсов и поместить его в новый 100-миллиметровый блюдо, содержащее 1 миллилитр DMEM с 1%пенициллин стрептомицин. Измельчите очищенный яички стерильными ножницами на кусочки ткани от одного до двух миллиметров. После измельчения используйте стерильные типсы для удаления белых фрагментов соединительной ткани.
Передача кусочков рубленой ткани в раствор А в 50 миллилитровую трубку и пополнить его до 50 миллилитров с DMEM, чтобы получить концентрацию 0,4 миллиграмма на миллилитр для колагеназы 4S и концентрации 0,8 миллиграмма на миллилитр для колагеназы 4W. Поместите трубку, содержащую кусочки ткани, в водяную баню 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Аккуратно инвертировать трубку каждые пять минут.
Через 30 минут центрифуга трубки в 90 раз G с перерывами при 25 градусах по Цельсию в течение 1,5 минут. Отбросьте супернатант, объявление 40 миллилитров раствора B, и пополнить до 50 миллилитров с DMEM, чтобы получить концентрацию 1,2 миллиграмма на миллилитр колагеназы 4W. Поместите трубку в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 30 минут и осторожно инвертировать трубку каждые пять минут.
Центрифуга трубки при 90 раз G с перерывами при 25 градусах по Цельсию в течение 1,5 минут. После этого отбросить супернатант, и мыть один раз с PBS с 1%пенициллин стрептомицин. Тщательно соберите трубочку сверху и поместите в новую 50-миллилитровую трубку.
Пополнить трубку с PBS до 50 миллилитров. Центрифуга труб труб при 90 раз G с перерывами при 25 градусах по Цельсию в течение 1,5 минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте свежий PBS, чтобы вымыть еще два раза.
После последней стирки PBS удалить супернатант и повторно приостановить семенные трубочки в пять миллилитров PBS. Затем добавьте 15 миллилитров 0,25%Трипсина EDTA в трубоубивания. Поместите трубку в 37 градусов по Цельсию водяной бане и осторожно инвертировать каждые две минуты.
Через пять минут оцените энзиматическое переваривание трубок до одиночных клеток под микроскопом с помощью 10 микролитров образца на пластине культуры тканей. Каждые две минуты поместите образец под микроскоп для наблюдения. Если в основном одиночные клетки могут быть обнаружены остановить реакцию с пятью миллилитров FBS и фильтр через 70 микрон сетки, а затем через 40 микрон сетки.
Центрифуга одиночных клеток при 500 раз G с перерывами при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Повторно приостановить в 50 миллилитров обогащения среды, и подсчитать количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра. Передача 20 миллионов этой стартовой популяции клеток в каждую из двух сверхнизких вложений 100 миллиметров чаш Петри и инкубации в инкубаторе культуры тканей при 37 градусах по Цельсию, 5%углекислого газа и 21% кислорода в течение двух дней.
Уступить от 20 до 25 миллионов клеток оставшейся популяции стартовых клеток на 100 миллиметров ткани культуры блюдо в общем объеме восемь миллилитров обогащения среды. Поместите блюдо в инкубатор и через 1,5 часа убедитесь, что большинство клеток Сертоли прикреплены к пластине. Слегка наклоните две пластины, чтобы собрать и объединить супернатанты в одну новую 100-миллиметровую пластину и поместить ее обратно в инкубатор.
Через час снова объедините супернатанты из двух пластин в новую 100-миллиметровую пластину. Поместите тарелки обратно в инкубатор на ночь. Затем соберите обогащенные зародышевые клетки в две фракции, непритягатые фракции и слегка приверженные фракции.
Соберите супернатант в качестве неприядаемой фракции. Для слегка придерживаться фракции мыть пластины осторожно с PBS и лечить с двумя миллилитров от одного до 20 разбавления 0,25%Trypsin EDTA в течение пяти минут при комнатной температуре. Остановите реакцию, добавив два миллилитров среды обогащения и соберите в непритятаемой фракционной трубке.
Объедините препарат стартовых клеток и обогащенные зародышевые клетки в трубке, чтобы получить препарат рабочей клетки, содержащий 25%зародышевые клетки. Центрифуга при 500 раз G с перерывами при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и повторно приостановьте клетки в 20 миллилитров среды органоидного образования, чтобы достичь концентрации 2,4 миллиона клеток на миллилитр.
В новую трубку добавить один миллилитр раствора, содержащего клетки. Добавьте 0,5 миллилитров раствора для полоскания сурфактантов к каждой колодец в микро-пластине. Убедитесь, что пузырьки воздуха не попали в колодец.
Для удаления пузырьков воздуха центрифуга пластины на 2000 раз G с перерывами при 25 градусов по Цельсию в течение двух минут. Наблюдайте за пластиной под перевернутым микроскопом с низким увеличением, чтобы убедиться, что пузырьки были удалены из микро скважин. Накройте тарелку крышкой и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
После завершения процедуры удалите промывку раствора и немедленно промойте тарелку стерильной водой или PBS. Добавьте 0,5 миллилитров органоидной среды образования к каждой хорошо и центрифуги при 2000 раз G с перерывами при 25 градусах по Цельсию в течение двух минут, чтобы удалить любые захваченные пузырьки воздуха. Наблюдайте хорошо под низким увеличением перевернутый микроскоп, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха были удалены.
Добавьте 0,5 миллилитров подвески рабочей ячейки и аккуратно перемешайте с помощью трубок вверх и вниз. Центрифуга при 500 раз G с перерывами при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Используйте перевернутый микроскоп, чтобы убедиться, что клетки сгруппированы внутри микро скважин.
Перенесите пластину в инкубатор клеточной культуры и культуры в течение пяти дней. Изменение половины среды через день. Для восстановления органоидов использовать широко ртом пипетки мягко пипетки среды вверх и вниз.
Это позволяет органоидам выходить из микро скважин. Соберите органоиды, исправить и выполнить иммуноцитохимии для маркера зародышевых клеток, маркер клеток Сертоли, перитубулярный маркер миоидных клеток и маркер клеток Лейдиг и визуализировать под конфокальный микроскоп. В этом исследовании изолированные клетки из недельного свиного яичка, которые были откололись в микро-колодцах, самоорганизованных в сфероиды с очерченными и отчетливыми внешними и внутренними отсеками.
Два отсека были разделены коллагеном IV положительной мембраны подвала. GATA4 положительные клетки Sertoli и UCHL1 положительные зародышевые клетки были во внешнем отсеке на мембране подвала. ASMA положительные пери-трубчатые миоидные клетки были локализованы вдоль внутренней части мембраны подвала в то время как CYP450 положительные клетки Leydig были в центре интерстиция.
Эта структура похожа на условия In Situ, где клетки Лейдига, пери-трубчатые миоидные клетки, расположены в интерстициуме, в интерстициальных отсеках и зародышевых клетках, клетки Сертоли расположены в семенном эпителии. Важно обеспечить, чтобы клетки, используемые для генерации органоидов, были оптимального качества. Тщательное внимание следует уделить на этапе трипсинизации энзиматической пищеварения.
После этой процедуры органоиды могут быть выучаты в долгосрочной перспективе для изучения дифференциации зародышевых клеток или анализа экспрессии генов и секретируемых белков или гормонов. Способность создавать органоиды с помощью ассоциаций клеток, специфичных для яичка, обеспечивает новую систему in-vitro для изучения клеточно-клеточных взаимодействий, важных для развития яичка и функции зародышевых клеток.
