Dieses Protokoll ist wichtig, weil es die Erzeugung von Hodenorganoiden ermöglicht, die als Plattform für die Untersuchung der Hodenmorphogenese und für Tests mit hohem Tropomedikament und Toxizität spämisch genutzt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie sehr reproduzierbar ist, eine relativ geringe Anzahl von Zellen benötigt und verwendet werden kann, um eine große Anzahl von Hodenorganoiden mit hodenspezifischer Architektur zu erzeugen. Diese Methode kann angewendet werden, um andere Systeme zu untersuchen, wie pluripotente Stammzellen oder Pankreas-Isletzellen mit den notwendigen Optimierungen.
Demonstriert wird das enzymatische Verdauungsverfahren des Hodengewebes von Anna Voigt, einer Doktorandin aus meinem Labor. Die Hoden in ein steriles Becherglas einsammeln und mit PBS waschen, das 1%Penicillin-Streptomycin enthält. Nach dem Waschen den Hoden auf eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale mit PBS mit 1%Penicillin-Streptomycin übertragen.
Verwenden Sie autoklavierte Schere und Zange, um die Tunika vaginalis und epididymis zu entfernen. Den isolierten Hoden auf eine neue 100-Millimeter-Schale übertragen und gründlich mit PBS waschen, das 1%Penicillin-Streptomycin enthält. Schneiden Sie die Hoden entlang der Längsachse direkt unter der Tunika.
Dann schälen Sie die Hoden aus der Tunika mit zwei Zangen und legen Sie sie in eine neue 100-Millimeter-Schale mit 1 Milliliter DMEM mit 1%Penicillin Streptomycin. Den geschälten Hoden mit steriler Schere in ein bis zwei Millimeter Gewebestücke zerkleinern. Nach dem Hacken verwenden Sie sterile Zangen, um die weißen Fragmente des Bindegewebes zu entfernen.
Übertragen Sie die gehackten Gewebestücke in Lösung A in einem 50-Milliliter-Rohr und verladen Sie sie auf 50 Milliliter mit DMEM, um eine Konzentration von 0,4 Milligramm pro Milliliter für Diekolagenase 4S und eine Konzentration von 0,8 Milligramm pro Milliliter für Kolagenase 4W zu erhalten. Legen Sie das Rohr mit den Gewebeteilen 30 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius Wasserbad. Umkehren Sie das Rohr alle fünf Minuten sanft.
Nach 30 Minuten zentrieren Sie das Rohr bei 90 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für 1,5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, ad 40 Milliliter der Lösung B, und toppen Sie bis zu 50 Milliliter mit DMEM, um eine Konzentration von 1,2 Milligramm pro Milliliter Kolagenase 4W zu erhalten. Legen Sie die Röhre für 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius Wasserbad und umkehren Sie das Rohr alle fünf Minuten sanft.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 90 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für 1,5 Minuten. Danach den Überstand entsorgen und einmal mit PBS mit 1%Penicillin Streptomycin waschen. Sammeln Sie die Tubuli vorsichtig von oben und legen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Rohr.
Aufladen Sie das Rohr mit PBS bis zu 50 Millilitern. Zentrifugieren Sie die Tubuli bei 90 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für 1,5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie frische PBS hinzu, um zwei weitere Male zu waschen.
Nach der letzten PBS-Waschung entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die seminiferen Tubuli in fünf Milliliter PBS wieder auf. Dann fügen Sie 15 Milliliter 0.25%Trypsin EDTA zu den Tubuli hinzu. Legen Sie das Rohr in ein 37 Grad Celsius Wasserbad und alle zwei Minuten sanft umkehren.
Nach fünf Minuten die enzymatische Verdauung von Tubuli an einzelnen Zellen unter dem Mikroskop mit 10 Mikrolitern Probe auf einer Gewebekulturplatte bewerten. Alle zwei Minuten stellen Sie die Probe unter das Mikroskop, um sie zu beobachten. Wenn meist einzelne Zellen nachgewiesen werden können, stoppen Sie die Reaktion mit fünf MilliliterFBS und filtern durch ein 70-Mikron-Netz und dann durch ein 40-Mikron-Netz.
Zentrifugieren Sie die einzelnen Zellen bei 500 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Re-suspend in 50 Milliliter Anreicherungsmedium, und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer. Übertragen Sie 20 Millionen dieser Ausgangszellpopulation in jede der beiden ultra-niedrigen Befestigung 100 Millimeter Petrischalen und inkubieren in einem Gewebe-Kultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff für zwei Tage.
Cede 20 bis 25 Millionen Zellen der verbleibenden Ausgangszellpopulation pro 100 Millimeter Gewebekulturschale in einem Gesamtvolumen von acht Milliliter n an reicherieren. Legen Sie die Schale in einen Inkubator und stellen Sie nach 1,5 Stunden sicher, dass die Mehrheit der Sertoli-Zellen an der Platte befestigt sind. Neigen Sie zwei Platten leicht, um die Überräube zu sammeln und in einer neuen 100-Millimeter-Platte zu kombinieren und wieder in den Inkubator zu legen.
Nach einer Stunde wieder die Überräube zweier Platten zu einer neuen 100-Millimeter-Platte kombinieren. Legen Sie die Platten über Nacht wieder in den Inkubator. Dann sammeln Sie die angereicherten Keimzellen in zwei Fraktionen, nicht-anhaftende Fraktion und leicht anhaftende Fraktion.
Sammeln Sie den Überstand als die nicht-haftende Fraktion. Für die leicht haftende Fraktion die Platten vorsichtig mit PBS waschen und mit zwei Millilitern einer einbis 20 Verdünnung von 0,25%Trypsin EDTA fünf Minuten bei Raumtemperatur behandeln. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zwei Milliliter Anreicherungsmedium hinzufügen und in der nicht haftenden Bruchröhre sammeln.
Kombinieren Sie das Ausgangszellpräparat mit den angereicherten Keimzellen in einer Röhre, um ein Arbeitszellenpräparat mit 25% Keimzellen zu erhalten. Zentrifuge bei 500 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 20 Milliliterorganoid-Bildungsmedium, um eine Konzentration von 2,4 Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen.
In einem neuen Rohr fügen Sie einen Milliliter der Lösung, die Zellen enthält. Fügen Sie 0,5 Milliliter Tensidspüllösung zu jedem Brunnen in einer Mikrobrunnenplatte hinzu. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Brunnen gefangen sind.
Um Luftblasen zu entfernen zentrifugieren die Platte bei 2 000 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für zwei Minuten. Beobachten Sie die Platte unter einem invertierten Mikroskop mit niedriger Vergrößerung, um zu überprüfen, ob die Blasen aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Nach der Behandlung ist die Spüllösung vollständig entfernen und sofort waschen Sie die Platte mit sterilem Wasser oder PBS. Fügen Sie 0,5 Milliliter Organoid-Formationmedium zu jedem Brunnen und Zentrifuge bei 2.000 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für zwei Minuten, um alle gefangenen Luftblasen zu entfernen. Beobachten Sie den Brunnen unter einem invertierten Mikroskop mit niedriger Vergrößerung, um zu überprüfen, ob die Luftblasen entfernt wurden.
0,5 Milliliter der Arbeitszellenaufhängung hinzufügen und sanft vermischen, indem man nach oben und unten pfeift. Zentrifuge bei 500 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, um zu überprüfen, ob sich die Zellen in den Mikrobrunnen gruppiert haben.
Übertragen Sie die Platte für fünf Tage in einen Zellkultur-Inkubator und eine Kultur. Wechseln Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums. Um die Organoide zu erholen, verwenden Sie eine Breitmaulpipette, um das Medium sanft nach oben und unten zu pipette.
Dadurch können die Organoide aus den Mikrobrunnen herauskommen. Sammeln Sie die Organoide, fixieren und führen Sie Immunzytochemie für Keimzellmarker, Sertoli-Zellmarker, peritubulären Myoidzellmarker und Leydig-Zellmarker durch und visualisieren Sie unter einem konfokalen Mikroskop. In dieser Studie isolierten Zellen aus einwöchigen Schweinehoden, die in Mikrobrunnen selbst organisiert in Sphäroide mit abgegrenzten und unterschiedlichen Außen- und Innenfächern kultiviert wurden.
Die beiden Fächer wurden durch eine Kollagen IV positive Kellermembran getrennt. GATA4-positive Sertoli-Zellen und UCHL1-positive Keimzellen befanden sich im Außenfach auf der Kellermembran. aSMA positive peri-tubuläre Myoidzellen wurden entlang der Innenseite der Kellermembran lokalisiert, während CYP450 positive Leydig-Zellen im Zentrum des Interstitiums waren.
Diese Struktur ähnelt Den In-Situ-Bedingungen, bei denen sich Leydig-Zellen, peri-tubuläre Myoidzellen, im Interstitium, im Interstitiial-Kompartiment und keimzellen befinden, Sertoli-Zellen befinden sich am Seminiferepithel. Es ist wichtig sicherzustellen, dass Zellen, die verwendet werden, um Organoide zu erzeugen, eine optimale Qualität haben. Während der Trypsinisierungsphase der enzymatischen Verdauung sollte sorgfältig darauf geachtet werden.
Nach diesem Verfahren können die Organoide langfristig kultiviert werden, um die Keimzelldifferenzierung zu untersuchen oder auf Genexpression und sezernierte Proteine oder Hormone zu analysieren. Die Fähigkeit, Organoide mit hodenspezifischen Zellassoziationen zu erzeugen, bietet ein neuartiges In-vitro-System zur Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen, die für die Entwicklung von Hoden und die Keimzellfunktion wichtig sind.
