이 프로토콜은 고환 성구 의 생성을 허용하기 때문에 중요합니다, 고환 형태 발생을 연구하고 높은 트로피약물 및 독성 검진을 위한 플랫폼으로 사용될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 매우 재현 가능하며 상대적으로 적은 수의 세포가 필요하며 고환 특정 아키텍처를 사용하여 많은 수의 고환 오르가노이드를 생성하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 필요한 최적화를 가진 다능성 줄기 세포 또는 췌장 적각 세포와 같은 다른 시스템을 연구하기 위하여 적용될 수 있습니다.
고환 조직 효소 소화 절차를 시연하는 것은 안나 보이트, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다. 멸균 비커로 고환을 수집하고 1 %페니실린 연쇄 절제술을 포함하는 PBS로 세척하십시오. 세척 후 1%페니실린 연쇄상 구균을 함유한 PBS를 함유한 100mm 조직 배양 접시로 고환을 옮김하였다.
오토클레이브 가위와 집게를 사용하여 튜니카 질과 부피티미스를 제거하십시오. 분리된 고환을 새로운 100mm 접시로 옮기고 1%페니실린 연쇄상구균을 함유한 PBS로 철저히 세척합니다. 튜니카 바로 아래 세로 축을 따라 고환을 잘라냅니다.
그런 다음 두 개의 집게를 사용하여 튜니카에서 고환을 껍질을 벗기고 1 %페니실린 연쇄 절제술과 DMEM의 1 밀리리터를 포함하는 새로운 100 밀리미터 접시에 넣습니다. 껍질을 벗긴 고환을 멸균 가위로 1~2밀리미터 티슈 조각으로 다진다. 잘라낸 후 멸균 집게를 사용하여 결합 조직의 흰색 조각을 제거하십시오.
다진 조직 조각을 50 밀리리터 튜브에 용액 A로 옮기고 DMEM을 사용하여 최대 50밀리리터까지 올라가 콜라게나아제 4S의 밀리리터당 0.4 밀리그램의 농도와 콜라게나아제 4W의 밀리리터당 0.8밀리그램의 농도를 얻을 수 있습니다. 조직 조각이 들어 있는 튜브를 섭씨 37도의 수조에 30분간 놓습니다. 5분마다 튜브를 부드럽게 반전시다.
30분 후, 튜브를 90회 G로 원심분리하고 1.5분 동안 섭씨 25도에서 휴식을 취합니다. 슈퍼네티드, 광고 40 밀리리터의 솔루션 B를 폐기하고, DMEM을 사용하여 최대 50밀리리터를 얹어 콜라게나아제 4W의 밀리리터당 1.2밀리그램의 농도를 얻습니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣고 30분 동안 튜브를 부드럽게 반전시면 5분마다 튜브를 부드럽게 반전시다.
1.5 분 동안 섭씨 25도에서 휴식과 90 시간 G에서 튜브원심분리. 그 후 상체를 버리고, 1 %페니실린 연쇄 절제술로 PBS로 한 번 세척하십시오. 조심스럽게 상단에서 튜블러를 수집하고 새로운 50 밀리리터 튜브에 배치합니다.
최대 50 밀리리터의 PBS로 튜브를 위로 합니다. 90회 G의 튜블러를 원심분리하고 섭씨 25도에서 1.5분간 휴식을 취합니다. 상체를 버리고 신선한 PBS를 추가하여 두 번 더 씻습니다.
마지막 PBS 세척 후 슈퍼 나탄을 제거하고 PBS의 다섯 밀리리터에서 반열구 관을 다시 중단합니다. 그런 다음 튜블러에 0.25 %의 트립신 EDTA의 15 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조에 놓고 2분마다 부드럽게 반전합니다.
5 분 후 조직 배양 판에 샘플의 10 마이크로 리터와 현미경의 밑에 단 하나 세포에 관의 효소 소화를 평가합니다. 매 2 분마다 관찰 현미경 의 밑에 견본을 놓습니다. 대부분 단일 세포가 검출될 수 있다면 FBS의 5밀리리터를 가진 반응을 중지하고 70 미크론 메쉬를 통해 필터한 다음 40 미크론 메쉬를 통해 서식한다.
단일 세포를 500배 G로 원심분리하고 5분 동안 섭씨 25도에서 휴식을 취합니다. 농축 배지의 50 밀리리터에서 다시 중단하고 혈종계를 사용하여 실행 가능한 세포의 수를 계산합니다. 이 시작 세포 인구의 2,000만 마리를 각각 2개의 초저 부착 100mm 페트리 접시로 옮기고 2일 동안 37도, 5%의 이산화탄소와 21%의 산소를 조직 배양 인큐베이터로 배양한다.
100밀리미터 조직 배양 접시당 나머지 시작 세포 집단의 20~2,500만 개의 세포는 농축 배지의 총 부피8밀리리터이다. 접시를 인큐베이터에 넣고 1.5 시간 후에 대부분의 세르톨리 세포가 접시에 부착되도록하십시오. 두 개의 플레이트를 약간 기울여 수퍼네티를 하나의 새로운 100mm 플레이트에 모아 서식하여 인큐베이터에 다시 넣습니다.
한 시간 후, 다시 새로운 100 밀리미터 플레이트에 두 개의 플레이트의 슈퍼 네이너티드를 결합합니다. 플레이트를 하룻밤 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 그런 다음 농축 된 세균 세포를 두 분획, 비 부착 분수 및 약간 부착 된 분획으로 수집합니다.
상신을 부착되지 않은 분수로 수집합니다. 약간 부착 된 분수의 경우 PBS로 접시를 부드럽게 씻고 실온에서 5 분 동안 0.25 %의 1 ~ 20 희석2 밀리리터로 치료하십시오. 농축 배지의 2밀리리터를 첨가하여 반응을 멈추고 비 부착 분획 튜브에서 수집합니다.
25% 세균 세포를 포함하는 작업 세포 준비를 얻기 위하여 튜브에 있는 시작 세포 준비 및 농축한 세균 세포를 결합합니다. 500회 G의 원심분리기와 5분간 섭씨 25도에서 휴식을 취합니다. 상체를 버리고 20 밀리리터의 오르가노이드 형성 배지에서 세포를 다시 중단하여 밀리리터 당 240만 개의 세포 농도에 도달한다.
새로운 튜브에서 세포를 포함하는 용액의 1 밀리리터를 추가합니다. 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에 계면 활성제 헹구는 용액0.5 밀리리터를 추가합니다. 기포가 우물에 갇혀 있지 않도록 하십시오.
기포 원심분리기를 2, 000회 G로 제거하고 2분간 섭씨 25도에서 휴식을 취합니다. 낮은 배율 반전 현미경하에서 플레이트를 관찰하여 마이크로 우물에서 거품이 제거되었는지 확인합니다. 뚜껑으로 접시를 덮고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
처리가 완료되면 헹구는 용액을 제거하고 즉시 멸균물 또는 PBS로 접시를 세척하십시오. 각 우물에 0.5 밀리리터의 오르가노이드 형성 매체를 추가하고 25도에서 휴식과 2 5°C의 휴식과 원심분리기를 2분 동안 섭씨 25도에 추가하여 갇힌 기포를 제거합니다. 낮은 배율 반전 현미경하에서 우물을 관찰하여 기포가 제거되었는지 확인합니다.
작업 셀 서스펜션의 0.5 밀리리터를 추가하고 위아래로 파이프팅하여 부드럽게 섞습니다. 500회 G의 원심분리기와 5분간 섭씨 25도에서 휴식을 취합니다. 반전된 현미경을 사용하여 세포가 마이크로 웰 내에 클러스터되었는지 확인합니다.
5 일 동안 세포 배양 배양 및 배양으로 플레이트를 전송합니다. 격일로 매체의 절반을 변경합니다. 오르가노이드를 복구하려면 와이드 입 파이펫을 사용하여 중간 크기의 위아래로 부드럽게 피펫을 피펫합니다.
이를 통해 오간노이드가 마이크로 우물에서 나올 수 있습니다. 오르가노이드를 수집, 수정 및 세균 세포 마커에 대한 면역 세포 화학을 수행, 세르톨리 세포 마커, peritubular myoid 세포 마커 및 Leydig 세포 마커와 공초점 현미경에서 시각화. 이 연구에서는 마이크로 웰에서 배양 된 1 주일 된 돼지 고환에서 분리 된 세포를 묘사하고 뚜렷한 외부 및 내부 구획으로 스페로이드로 자체 구성했습니다.
두 구획은 콜라겐 IV 양성 지하 막에 의해 분리되었다. GATA4 양성 세르톨리 세포와 UCHL1 양성 세균 세포는 지하 막의 외부 구획에 있었다. aSMA 양성 페리 관 마이드 세포는 지하 막의 내부를 따라 국소화되었고 CYP450 양성 Leydig 세포는 간질의 중심에 있었다.
이 구조는 Leydig 세포, peri 관 마이드 세포가 중간 체획 및 세균 세포에서 중간 질에 위치한 시투 조건과 유사하며, 세르톨리 세포는 반열성 상피에 위치합니다. 오르가노이드를 생성하는 데 사용되는 세포가 최적의 품질을 가지고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 효소 소화의 트립시화 단계에서주의해야 한다.
이 절차에 따라 오르가노이드는 생식 세포 분화를 연구하거나 유전자 발현 및 분비 된 단백질 또는 호르몬을 분석하기 위해 장기적으로 배양 될 수 있습니다. 고환 특이적 세포 협회를 가진 오르가노이드를 만드는 기능은 고환 발달 및 생식 세포 기능에 중요한 세포 세포 상호 작용을 연구하기 위하여 새로운 체외 계통을 제공합니다.
