הפרוטוקול שלנו מספק שיטת אימות משופרת עבור כימריזם במחזור ושיטה להגדרת מודל פרביוזיס מוצלח למחקר ביו-רפואי. בהשוואה לשיטות הקיימות לגילוי כימריזם בדם בפרביוזיס שלעתים קרובות קטלניות או מסורבלות, הפרוטוקול שלנו בטוח ופשוט, ומאפשר אימות מהיר ואמין. למרות שיטה זו היא ספציפית לגילוי של כימריזם דם במודלים פרביוזיס, זה יכול להיות מיושם על כל מחקרים ביו מעורבים הליכים פרביוטיים.
הצעד המאתגר ביותר הוא הזרקת גלוקוז. לכן הקפד לתרגל את הזרקת וריד הזנב לפני ביצוע הליך ניסיוני, או להשתמש קיבוע זנב עכבר חזותי ורידים. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, מניחים שני 20 עד 25 גרם הרדמה C57 שחור 6 עכברים זכרים בתמונת supine, ולהשתמש מכונת גילוח חשמלית כדי לגלח ביסודיות את הצד השמאלי של עכבר אחד ואת הצד הימני של העכבר השני מסנטימטר אחד מעל המרפק לסנטימטר מתחת לברך.
הסר את כל השיער שנותר עם קרם depilatory לפני ביצוע חתכים בעור האורך בעור מנוקה של כל בעל חיים, החל 0.5 ס"מ מעל המרפק ל 0.5 ס"מ מתחת למפרק הברך, בעדינות לנתק את העור מן fascia תת עורי. חבר את olecranon ואת הברך של parabiont עם תפר 3-0, ולתפור את העור מגולח עם תפר רציף 5-0. ואז להזריק תת עורית 0.5 מיליליטר של 0.9% נתרן כלורי כדי למנוע התייבשות, ולהזריק תוך שרירית 10 מיליגרם של tramadol לכל 25 גרם של עכבר כדי להקל על הכאב, לתוך כל עכבר ליום במשך שלושה ימים.
כדי לאמת את הבנייה המוצלחת של זרימת הדם בין כימריזם בין פרביונטים על ידי תנודות גלוקוז, ביום העשירי לאחר ניתוח פרביוזיס, לאבטח את העכברים התורמים בקיבוע זנב עכבר חזותי ורדי, ולהשתמש 70 עד 75% כדור כותנה ספוג אתנול לשפשף את הוורידים caudal באגף של זנב אחד parabiont. הכנס מחט מזרק של מיליליטר אחד לתוך וריד caudal 2-4 ס"מ מקץ הזנב ובמקביל לווריד ככל האפשר, ולהזריק אחד עד שני גרם לקילוגרם של גלוקוז ב 100 microliters של תמיסת מלח לתוך התורם על תקופה של 10 שניות. לאחר מכן להשתמש במספריים כדי להסיר את בהונות מן התורם ואת בעלי החיים הנמען כדי לאפשר איסוף של טיפת דם בנקודות זמן שונות של עניין לאחר הזריקה.
לאחר מכן הוסיפו טיפה של כל דגימת דם למרכז רצועת בדיקת גלוקומטר לגילוי רמת הגלוקוז. כדי לאמת את הבנייה המוצלחת של זרימת הדם על ידי ספיגת צבע כחול אוונס, להזריק 200 microliters של 0.5% אוונס כחול נגד להכתים תוך פרטית לתוך העכבר התורם, ולאסוף דם משני parabionts על ידי ניקוב לב לאחר שעתיים. מפרידים את הסרום באמצעות צנטריפוגה, ומעבירים את הסרום לצינור חרוט לדילול ביחס של 1 עד 50 ב-0.9% נתרן כלורי.
לאחר מכן למדוד את הספיגה של דגימות סרום מדולל ב 620 ננומטר על ספקטרופוטומטר. בניתוח מייצג זה של רמות הגלוקוז בדם בשישה עכברים תורמים, רמת הגלוקוז בדם עלתה בחדות ל-26.5 מיקרומולאר לליטר בממוצע דקה לאחר הזרקת 100 מיקרוליטר של גלוקוז דרך וריד הזנב. רמות הגלוקוז בדם ירדו בהדרגה ל-13.3 מיקרוליטר לליטר ב-60 דקות.
בעכברים המטופל, הגלוקוז בדם גדל לאט לאחר ההזרקה, והגיע לרמת השיא הראשונה ב 15 דקות. הריכוז של צבע כחול אוונס בסרום של פרביונטיות הצביע גם על בנייה מוצלחת של כימריזם מחזור הדם, וצמתים תת עוריים בין הפרביומונים ניתן היה לראות בבירור. בפרביונטיות שלא ביסידו כימריזם דם 15 יום לאחר ניתוח הפרביוזיס, העכברים המטופלים לא הציגו רמת גלוקוז מוגברת בדם תוך 60 דקות לאחר הזרקת גלוקוז לחיה התורמת.
גם ריכוז הדם של כחול אוונס בשני המטופלים לא הועלה, מה שמוכיח ששיטת תנודות הגלוקוז רגישה כמו השיטה הכחולה של אוונס. יתר על כן, רמת האינסולין בדם ירדה באופן משמעותי שעה לאחר הזרקת הגלוקוז בגלל רמות הגלוקוז המוגברות במהירות והתאוששה לרמות נורמליות בשלוש שעות, מה שמצביע על כך שההשפעות של הגלוקוז המוזרק על חילוף החומרים של האינסולין ניתנות לשחזור. יש לדאוג לוודא כי המחט מוכנס ישירות לתוך וריד הזנב.
לאחר אישור כימריזם הדם של פרביונטים בשיטה זו, שינויים פיזיולוגיים ניתן ללמוד בבעלי חיים פרביוטיים חיים.
