当社のプロトコルは、循環キメラリズムの改善された検証方法と、生物医学研究のためのパラバイオシスモデル設定を成功させるための方法を提供します。多くの場合、致死的または面倒であるパラバイオシスにおける血液キメラリズムの検出のための既存の方法と比較して、私たちのプロトコルは安全で簡単であり、迅速かつ信頼性の高い検証を可能にします。この方法は、パラバイオシスモデルにおける血液キメラリズムの検出に特異的であるが、パラバイオティクス処置を含むあらゆる生物医学的研究に適用することができる。
最も困難なステップは、グルコース注入です。したがって、実験手順を行う前に尾静脈注射を練習するか、静脈視覚的マウス尾部固定剤を使用してください。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、20〜25グラムの麻酔付きC57黒6雄マウスをスピービン位置に置き、電気剃りを使用して1匹のマウスの左側と2番目のマウスの右側を肘の上約1センチメートルから膝の下1センチメートルまで徹底的に剃ります。
肘の上0.5センチメートルから膝関節の下0.5センチメートルまで、各動物のクリアされた皮膚に縦方向の皮膚切開を行う前に脱毛クリームで残りの毛髪を取り除き、皮下筋膜から皮膚をそっと剥離します。パラビオントのオレクラノンと膝を3-0縫合で接続し、剃った皮膚を5-0縫合で縫合する。その後、皮下に0.5ミリリットルの0.9%塩化ナトリウムを注入して脱水症状を防ぎ、筋肉内にマウス25グラムあたり10ミリグラムのトラマドールを注入して痛みを和らげ、1日あたり1匹ずつ3日間注射する。
グルコース変動によるパラバイオント間のキメラリズム間の循環の正常な構築を検証するために、パラバイオシス手術後10日目に、ドナーマウスを静脈視覚マウス尾固定器に固定し、70〜75%エタノール浸し綿球を使用して、1つのパラバイオント尾部の側面で尾静脈をこすります。尾端から2〜4センチメートル、可能な限り静脈に平行な尾静脈に1ミリリットルの注射針を挿入し、100マイクロリットルの生理食塩水中のグルコース1キログラム当たり1〜2グラムを10秒間ドナーに注入する。次に、注射後の様々な時点での血液の滴を可能にするために、ドナーおよびレシピエント動物からつま先を取り除くためにはさみを使用する。
次に、各血液サンプルの滴をグルコメータテストストリップの中央に加え、グルコースレベル検出を行います。エバンスブルー色素吸光度による循環の成功した構築を確認するには、0.5%のエバンスブルーカウンターステインの200マイクロリットルをドナーマウスに腹腔内に注入し、2時間後に心臓穿刺によって両方のパラバイオントから血液を採取する。遠心分離によって血清を分離し、0.9%の塩化ナトリウムで1〜50比で希釈するために円錐形チューブに血清を移す。
次に、分光光度計で620ナノメートルで希釈した血清サンプルの吸光度を測定します。6匹のドナーマウスにおける血糖値のこの代表的な分析では、血糖値は、尾静脈を通して100マイクロリットルのグルコースを注入した後、平均1分で1リットル当たり26.5マイクロモルに急激に増加した。血糖値は、その後、徐々に60分でリットル当たり13.3マイクロリットルに減少しました。
レシピエントマウスでは、注入後に血糖値が徐々に増加し、15分で最初のピークレベルに達した。パラバイオエントの血清中のエバンスブルー染料の濃度はまた、循環キメラリズムの構築に成功したことを示し、パラバイオント間の皮下血管接合部は明確に観察することができた。パラバイオシス手術の15日後に血中キメリズムを確立しなかったパラバイオエントでは、レシピエントマウスは、ドナー動物へのグルコース注入後60分以内に血糖値の上昇を示さなかった。
2人のレシピエントにおけるエバンスブルーの血中濃度も上昇しておらず、グルコース変動法がエバンスブルー法と同じくらい敏感であることを実証した。さらに、血中インスリン濃度は、グルコースレベルの急速な増加によりグルコース注射の1時間後に著しく低下し、3時間の正常レベルまで回復し、インスリン代謝に対する注入されたグルコースの効果が回復可能であることを示している。針が尾静脈に直接挿入されていることを確認するように注意してください。
この方法によりパラバイオントの血中キメラリズムを確認した後、生理病理学的変化を生きたパラバイオティクス動物で研究することができる。
