Il nostro protocollo fornisce un metodo di verifica migliorato per il chimerismo di circolazione e un metodo per una configurazione del modello di parabiosi di successo per la ricerca biomedica. Rispetto ai metodi esistenti per il rilevamento del chimerismo sanguigno in parabiosi che sono spesso letali o ingombranti, il nostro protocollo è sicuro e semplice, consentendo una verifica rapida e affidabile. Sebbene questo metodo sia specifico per il rilevamento del chimerismo sanguigno nei modelli di parabiosi, può essere applicato a qualsiasi studio biomedico che coinvolga procedure parabiotiche.
Il passo più impegnativo è l'iniezione di glucosio. Pertanto, assicurarsi di praticare l'iniezione della vena della coda prima di eseguire una procedura sperimentale o utilizzare un fissatore di coda del mouse visivo venoso. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, posizionare due topi maschi C57 neri 6 neri da 20 a 25 grammi nella posizione supina e utilizzare un rasoio elettrico per radere accuratamente il lato sinistro di un mouse e il lato destro del secondo mouse da circa un centimetro sopra il gomito a un centimetro sotto il ginocchio.
Rimuovere i capelli rimanenti con crema depilatoria prima di effettuare incisioni longitudinali della pelle nella pelle chiara di ogni animale, a partire da 0,5 centimetri sopra il gomito a 0,5 centimetri sotto l'articolazione del ginocchio e staccare delicatamente la pelle dalla fascia sottocutanea. Collegare l'olecranone e il ginocchio del parabionte con sutura 3-0 e suturare la pelle rasata con una sutura continua 5-0. Quindi iniettare per via sottocutanea 0,5 millilitri di cloruro di sodio allo 0,9% per prevenire la disidratazione e iniettare per via intramuscolare 10 milligrammi di tramadolo per 25 grammi di topo per alleviare il dolore, in ogni topo al giorno per tre giorni.
Per verificare la riuscita costruzione della circolazione tra i parabionti per fluttuazione del glucosio, il 10 ° giorno dopo l'intervento di parabiosi, fissare i topi donatori in un fissatore della coda del topo visivo venoso e utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo dal 70 al 75% per strofinare le vene caudali sul fianco di una coda parabionte. Inserire un ago della siringa da un millilitro nella vena caudale da due a quattro centimetri dalla punta della coda e il più parallelo possibile alla vena e iniettare da uno a due grammi per chilogrammo di glucosio in 100 microlitri di soluzione salina nel donatore per un periodo di 10 secondi. Quindi utilizzare le forbici per rimuovere le dita dei piedi dal donatore e dagli animali riceventi per consentire la raccolta di una goccia di sangue in vari punti di interesse dopo l'iniezione.
Quindi aggiungere una goccia di ogni campione di sangue al centro di una striscia di test del glucometro per il rilevamento del livello di glucosio. Per verificare la corretta costruzione della circolazione da parte dell'assorbanza del colorante blu Evans, iniettare 200 microlitri dello 0,5% blu Evans controsostenibili intraperitonealmente nel topo donatore e raccogliere sangue da entrambi i parabionti per puntura cardiaca dopo due ore. Separare il siero per centrifugazione e trasferire il siero in un tubo conico per la diluizione ad un rapporto uno a 50 nel cloruro di sodio allo 0,9%.
Quindi misurare l'assorbanza dei campioni di siero diluiti a 620 nanometri su uno spettrofotometro. In questa analisi rappresentativa dei livelli di glucosio nel sangue in sei topi donatori, la glicemia è aumentata bruscamente a 26,5 micromolari per litro a una media di un minuto dopo l'iniezione di 100 microlitri di glucosio attraverso la vena della coda. I livelli di glucosio nel sangue sono quindi gradualmente diminuiti a 13,3 microlitri per litro a 60 minuti.
Nei topi ricevente, la glicemia è lentamente aumentata dopo l'iniezione, raggiungendo il primo livello di picco a 15 minuti. La concentrazione di colorante blu Evans nel siero dei parabionti indicò anche una costruzione riuscita del chimerismo di circolazione, e le giunzioni vascolari sottocutanee tra i parabionti potevano essere chiaramente osservate. Nei parabionti che non hanno stabilito il chimerismo del sangue 15 giorni dopo l'intervento di parabiosi, i topi riceventi non hanno mostrato un aumento del livello di glucosio nel sangue entro 60 minuti dopo l'iniezione di glucosio nell'animale donatore.
Anche la concentrazione di sangue di Evans blue nei due destinatari non è stata elevata, dimostrando che il metodo di fluttuazione del glucosio è sensibile come il metodo blu Evans. Inoltre, il livello di insulina nel sangue è stato notevolmente diminuito un'ora dopo l'iniezione di glucosio a causa del rapido aumento dei livelli di glucosio e recuperato a livelli normali di tre ore, indicando che gli effetti del glucosio iniettato sul metabolismo dell'insulina sono riparibili. Fare attenzione a assicurarsi che l'ago sia inserito direttamente nella vena della coda.
Dopo aver confermato il chimerismo sanguigno dei parabionti con questo metodo, i cambiamenti fisiopatologici possono essere studiati negli animali parabiotici vivi.
