Nosso protocolo fornece um método de verificação aprimorado para o chimerismo de circulação e um método para uma configuração bem-sucedida do modelo de parabiose para pesquisa biomédica. Comparado com os métodos existentes para a detecção de chimerismo sanguíneo na parabiose que muitas vezes são letais ou complicados, nosso protocolo é seguro e simples, permitindo uma verificação rápida e confiável. Embora este método seja específico para a detecção do chimerismo sanguíneo em modelos de parabiose, pode ser aplicado a quaisquer estudos biomédicos envolvendo procedimentos parabióticos.
O passo mais desafiador é a injeção de glicose. Portanto, certifique-se de praticar a injeção da veia da cauda antes de realizar um procedimento experimental, ou usar um fixador de cauda visual venoso. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, coloque dois camundongos c57 pretos c57 de 20 a 25 gramas na posição supina, e use um barbeador elétrico para raspar completamente o lado esquerdo de um rato e o lado direito do segundo rato de aproximadamente um centímetro acima do cotovelo para um centímetro abaixo do joelho.
Remova qualquer cabelo restante com creme depilatório antes de fazer incisões longitudinais na pele limpa de cada animal, começando de 0,5 centímetros acima do cotovelo para 0,5 centímetros abaixo da articulação do joelho, e desprender suavemente a pele da fáscia subcutânea. Conecte o olecranon e o joelho do parabionte com sutura 3-0, e sutura a pele raspada com uma sutura contínua 5-0. Em seguida, injete subcutâneamente 0,5 mililitros de cloreto de sódio de 0,9% para evitar a desidratação, e injete intramuscularmente 10 miligramas de tramadol por 25 gramas de rato para aliviar a dor, em cada rato por dia durante três dias.
Para verificar a construção bem sucedida de circulação entre os parabiontes por flutuação de glicose, no 10º dia após a cirurgia de parabiose, fixar os camundongos doadores em um fixador de cauda de rato visual venoso, e usar uma bola de algodão 70 a 75% encharcada de etanol para esfregar as veias caudais no flanco de uma cauda parabionte. Insira uma agulha de seringa de um mililitro na veia caudal de dois a quatro centímetros da ponta da cauda e o mais paralelo possível à veia, e injete de um a dois gramas por quilograma de glicose em 100 microlitres de solução salina no doador em um período de 10 segundos. Em seguida, use uma tesoura para remover os dedos dos dedos dos animais doadores e receptores para permitir a coleta de uma gota de sangue em vários momentos de interesse após a injeção.
Em seguida, adicione uma gota de cada amostra de sangue no centro de uma tira de teste de glucometer para detecção do nível de glicose. Para verificar a construção bem sucedida da circulação por evans absorvente de corante azul, injete 200 microliters de 0,5% Evans contra-mancha azul intraperitoneal no rato doador, e colete sangue de ambos os parabiontes por punção cardíaca após duas horas. Separe o soro por centrifugação e transfira o soro para um tubo cônico para diluição em uma proporção de um a 50 em cloreto de sódio de 0,9%.
Em seguida, meça a absorvência das amostras de soro diluído em 620 nanômetros em um espectrofotômetro. Nesta análise representativa dos níveis de glicose no sangue em seis camundongos doadores, a glicemia aumentou acentuadamente para 26,5 micromolar por litro, em média um minuto após a injeção de 100 microliters de glicose pela veia traseira. Os níveis de glicose no sangue diminuíram gradualmente para 13,3 microliters por litro em 60 minutos.
Em camundongos receptores, a glicemia aumentou lentamente após a injeção, atingindo o primeiro nível de pico em 15 minutos. A concentração de corante azul evans no soro dos parabiontes também indicou uma construção bem sucedida de chimerismo de circulação, e junções vasculares subcutâneas entre os parabiontes poderiam ser claramente observadas. Em parabiontes que não estabeleceram chimerismo sanguíneo 15 dias após a cirurgia de parabiose, os camundongos receptores não apresentaram aumento do nível de glicose no sangue em 60 minutos após a injeção de glicose no animal doador.
A concentração sanguínea de Evans azul nos dois receptores também não foi elevada, demonstrando que o método de flutuação de glicose é tão sensível quanto o método azul evans. Além disso, o nível de insulina no sangue foi significativamente diminuído uma hora após a injeção de glicose devido ao rápido aumento dos níveis de glicose e recuperado aos níveis normais em três horas, indicando que os efeitos da glicose injetada no metabolismo da insulina são restauráveis. Tenha cuidado para ter certeza de que a agulha está inserida diretamente na veia da cauda.
Após a confirmação do chimerismo sanguíneo dos parabiontes por este método, alterações fisiopatológicas podem ser estudadas em animais parabióticos vivos.
