אתגר אחד בתחום הביולוגיה של השם היה לשמור על אדיפוסיט בוגר בתרבות. פיתחנו שיטה חדשה המאפשרת חקר של adipocyte לטווח ארוך לאורך שינויים גדולים. טכניקת תרבות האדיפוזיטים שלנו מאפשרת חקר אינטראקציות בין תאים ובתקווה תהיה שימושית לפיתוח טיפולים חדשים לסוכרת והשמנת יתר.
חשוב לעקוב אחר הפרוטוקול בזהירות כמו ישנם כמה צעדים קריטיים המשפיעים מאוד על איכות הגן ואת הכדאיות של adipocytes בוגרת. לדוגמה, לפני ציפוי לוודא כי כל השומנים החופשיים ואת חיץ לשטוף הוסר אחרת lipocytes יכול לקרוע כאשר מוסיפים הפוכים. לאחר קבלת דגימת רקמת השומן התת עורית האנושית, מניחים את הרקמה בארון בטיחות ביולוגי סטרילי בצלחת פטרי באורך 15 ס"מ.
נפח קטן של בינוני 199 לצלחת. השתמש פינצטה לתפוס כלי פיברוטי גדול בתוך הרקמה ולהשתמש בחלק האחורי של קצה של זוג סגור של מספריים כדי לגרד בעדינות את השומן לאורך הכלי כדי לשחרר את adipocytes. כאשר כל התאים נאספו להשליך את חתיכות גדולות של רקמה fibrotic ולשקול את השומן גזוז.
כדי לשחרר עוד יותר את התאים מרקמת השומן, להעביר 10 גרם של רקמת שומן לתוך צלחת חדשה 15 ס"מ פטרי ולהשתמש מספריים מעוגלים כדי לטחון בזהירות את השומן עד שהוא הופך תערובת הומוגנית חלקה ללא חתיכות גדולות של שומן. כאשר כל השומן עובד, להשתמש בכף להעביר 10 מיליליטר של רקמה טחון לתוך צינורות בודדים 50 מיליליטר ולהוסיף 30 מיליליטר של חיץ עיכול לכל צינור. לאחר מכן מניחים את הצינורות באינקובטור רועד ב 37 מעלות צלזיוס ו 150 סיבובים לדקה במשך 30 עד 35 דקות.
העיכול הושלם כאשר תקציר הפתגם הומוגני, בצבע משמש, ונעדר חתיכות גדולות. בסוף העיכול, decant פתרון השומן מתעכל לתוך מסנן רשת 250 מיקרומטר בתוך משפך להגדיר בקבוק ליטר סטרילי אחד. כאשר כל נפח ההשעיה adipocyte כבר חמק, בעדינות לסחוט את מסנן רשת כדי להגדיל את התשואה של adipocytes ולשטוף את המסנן עם 50 עד 100 מיליליטר של חיץ לשטוף לפני לסחוט את המסנן שוב.
מעבירים את תספורת האדיפוזיטים המבודדת למשפך הפרדה ומוסיפים חיץ רחצה עד שהמשפך מתמלא כמעט לחלוטין. בעדינות להפוך את המשפך כמה פעמים כדי לערבב את ההשעיה adipocyte עם החיץ ולתת את המתלה לעמוד במשך שתיים עד שלוש דקות עד שיש הפרדה ברורה של השכבות. כאשר השכבות נפרדו, לפתוח את הזרבובית על המשפך לאט לחמוק הפתרון התחתון לתוך בקבוק סטרילי.
כאשר כל הקולגנס הוסר, לאסוף את הפתרון adipocyte בוגר מטוהרים ב 50 צינורות חרוט מיליליטר ולארוז קלות את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, השתמש מזרק 10 מיליליטר מצויד מחט 18 מד כדי להסיר את מאגר לשטוף הנותרים מתחת ההשעיה adipocyte ולהשתמש פיפטה כדי להסיר את שכבת השומנים החופשית צף מעל adipocytes בוגרת. עבור זריעת adipocytes בוגרת, מניחים את רכיב הכנס קרום חדיר במהופך על משטח סטרילי בעדינות להפוך את הצינורות של adipocytes ארוז כמה פעמים כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים.
בעזרת קצה פיפטה רחב, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של אדיפוזיטים בוגרים ארוזים על כל קרום. הפוך את לוח ההוספה בתנועה חלקה אחת כך שהדיפוזיטים עם הזרעים יהיה בתחתית ההוספות. מניחים את הפאנל של מוסיף לתוך צלחת 24 גם המכיל 500 כדי 1, 000 microliters של להשלים 37 מעלות צלזיוס בינוני לגם.
לאחר מכן, לכסות את הצלחת בזהירות למקם את הצלחת לתוך אינקובטור תרבות רקמות. כל שבעה ימים של תרבות, להחליף את המדיום דרך חור החיתוך בכל הכנס. לאחר שבוע של תרבות, אגרגטים adipocyte בוגר מבודד רקמת שומן תת עורית לשמור על מורפולוגיה טיפת השומנים unilocular אופייני נצפתה רק באדיפוזיטים בוגרים.
טיפול באגוניסטים PPAR-GAMMA pioglitazone ו rosiglitazone תוצאות ביטוי מוגבר בגנים מגיבים PPAR-GAMMA, ואילו טיפול עם אגוניסט קולטן glucocorticoid dexamethasone אין השפעה על גנים אלה. באופן דומה, אגוניסט הקולטן glucocorticoid מניע באופן חזק את ביטוי הגנים של גנים יעד קולטן glucocorticoid, בעוד אגוניסטים PPAR-GAMMA אין השפעות משמעותיות על גנים אלה. בנוסף, טיפול של שבעה ימים עם אגוניסטים PPAR-GAMMA גורם בחזקה את ביטוי הגן של הגן הספציפי שומן חום, UCP1.
המודל החדש שלנו adipocyte במבחנה יכול לשמש למחקרים פונקציונליים adipocytes בוגרת, כולל ספיגת גלוקוז, lipogenesis, וליפוזיזה. עם טכניקת תרבות האדיפוזיטים החדשה הזו הצלחנו להראות שהדיפוזיטים הלבנים הבוגרים האנושיים יכולים לעבור לאדיפוזיטים דמויי חום.
