지방 생물학 분야에서 한 가지 과제는 문화에서 성숙한 지방을 유지하는 것입니다. 우리는 큰 변화를 통해 장기 적혈구의 연구를 허용하는 새로운 방법을 개발했습니다. 우리의 지방 세포 배양 기술은 세포 상호 작용의 연구를 허용하고 잘하면 당뇨병과 비만에 대한 새로운 치료의 개발에 유용 할 것입니다.
유전자 품질과 성숙한 지방세포의 생존가능성에 크게 영향을 미치는 몇 가지 중요한 단계가 있기 때문에 프로토콜을 신중하게 따르는 것이 중요합니다. 예를 들어, 도금하기 전에 모든 무료 지질 및 세척 버퍼가 제거되었는지 확인하십시오 그렇지 않으면 삽입이 반전될 때 리포사이클이 벗겨질 수 있습니다. 인간 피하 지방 조직 샘플을 받은 후, 15cm 페트리 접시에 멸균 생물학적 안전 캐비닛에 조직을 배치합니다.
소량의 중간 199. 핀셋을 사용하여 조직 내의 큰 섬유질 혈관을 파악하고 닫힌 한 쌍의 끝의 뒷면을 사용하여 혈관을 따라 지방을 부드럽게 긁어 내어 지방을 방출합니다. 모든 세포가 수집되면 섬유 조직의 큰 조각을 버리고 손질 된 지방을 무게.
지방 조직에서 세포를 더 방출하기 위해 10 그램의 지방 조직을 새로운 15 센티미터 페트리 접시로 옮기고 곡선 가위를 사용하여 지방을 잘게 자게하여 큰 지방 조각이없는 부드러운 균질 혼합물이 될 때까지 조심스럽게 지방을 다진다. 모든 지방이 처리되면 숟가락을 사용하여 다진 조직의 10 밀리리터를 개별 50 밀리리터 튜브로 옮기고 각 튜브에 30 밀리리터의 소화 버퍼를 추가하십시오. 그런 다음 흔들리는 인큐베이터에 튜브를 섭씨 37도, 분당 150회전을 30~35분 동안 배치합니다.
지방 용액이 균일하고 살구색이며 큰 조각이 없을 때 소화가 완료됩니다. 소화가 끝나면 소화된 지방 용액을 멸균 1리터 플라스크로 설정된 깔때기 내부의 250 마이크로미터 메쉬 필터로 디게팅합니다. 대포세포 현탁액의 전체 부피가 제거되면 메쉬 필터를 부드럽게 짜서 백러를 다시 짜내기 전에 50~100밀리리터의 세척 버퍼로 필터를 세척합니다.
격리된 분리 형액을 분리 깔때기로 옮기고 깔때기가 거의 완전히 채워지 때까지 세척 버퍼를 추가합니다. 깔때기를 부드럽게 반전시켜 안구체 서스펜션을 버퍼와 혼합하고 레이어의 뚜렷한 분리가 있을 때까지 서스펜션이 2~3분 동안 방치하도록 합니다. 층이 분리되면 깔때기의 노즐을 열고 바닥 용액을 멸균 플라스크로 천천히 피합니다.
콜라게나아제의 모든 제거되면, 50 밀리리터 원모형 튜브에 정제 된 성숙한 지방 세포 용액을 수집하고 가볍게 원심 분리에 의해 세포를 포장. 이어서, 18 게이지 바늘을 장착한 10밀리리터 주사기를 사용하여 교포현 액수 아래에 남은 세척 버퍼를 제거하고 파이펫을 사용하여 성숙한 지방세포 위에 떠 있는 프리 지질층을 제거한다. 성숙한 안도세포의 파종의 경우, 투과성 멤브레인 인서트 성분을 멸균 표면에 거꾸로 놓고 포장된 지방세포의 튜브를 몇 번 부드럽게 반전하여 세포의 균일한 분포를 보장합니다.
넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 각 멤브레인에 포장된 성숙한 지방세포 30마이크로리터를 추가합니다. 시드 된 교신구가 인서트의 맨 아래에 있도록 하나의 부드러운 모션으로 삽입 패널을 반전. 삽입 패널을 500 ~1, 000 마이크로리터가 들어 있는 24개의 웰 플레이트에 잘 배치합니다.
그런 다음 접시를 덮고 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다. 7일마다 각 인서치의 컷아웃 구멍을 통해 배지를 교체한다. 문화의 1 주일 후, 피하 지방 조직으로부터 분리 된 성숙한 지방 체재는 성숙한 지방 세포에서만 관찰된 특징적인 외구 지질 액적 형태를 유지합니다.
PPAR-GAMMA 작용제 피오글리타존과 로시글리타존을 통한 치료는 PPAR-GAMMA 반응성 유전자에서 발현이 증가하는 반면, 글루코코르티코이드 수용체 고뇌의 치료는 이러한 유전자에 영향을 미치지 않는다. 유사하게, 글루코코르티코이드 수용체 작용제는 글루코코르티코이드 수용체 표적 유전자의 유전자 발현을 강력하게 유도하고, PPAR-GAMMA 작용제는 이 유전자에 유의한 효력이 없는 동안. 또한, PPAR-GAMMA 작용제와의 7일 치료는 갈색 지방 특이 유전자, UCP1의 유전자 발현을 강력하게 유도한다.
체외 모델의 새로운 지방세포는 포도당 섭취, 리포발생 및 지방분해를 포함한 성숙한 지방세포의 기능적 연구에 사용될 수 있습니다. 이 새로운 지방 세포 문화 기술을 통해 우리는 인간의 성숙한 흰색 지방 세포가 갈색과 같은 지방 세포로 변형 할 수 있음을 보여줄 수있었습니다.
