وكان أحد التحديات في مجال علم الأحياء الدهنية للحفاظ على ناضجة adipocyte في الثقافة. لقد طورنا طريقة جديدة تسمح بدراسة adipocyte على المدى الطويل في جميع أنحاء التغييرات الكبيرة. لدينا تقنية ثقافة adipocyte يسمح بدراسة التفاعلات الخلية ونأمل أن تكون مفيدة لتطوير علاجات جديدة لمرض السكري والسمنة.
من المهم اتباع البروتوكول بعناية حيث أن هناك بعض الخطوات الحاسمة التي تؤثر بشكل كبير على جودة الجينات وقابلية الخلايا الشحمية الناضجة للاستمرار. على سبيل المثال، قبل الطلاء تأكد من أن كل من الدهون الحرة وغسل المخزن المؤقت قد تمت إزالة وإلا يمكن أن مزق lipocytes قبالة عندما يتم عكس إدراج. بعد تلقي عينة الأنسجة الدهنية تحت الجلد البشري ، ضع الأنسجة في خزانة أمان بيولوجية معقمة في طبق بيتري طوله 15 سنتيمترًا.
حجم صغير من متوسطة 199 إلى الطبق. استخدام ملاقط لفهم الأوعية الليفية الكبيرة داخل الأنسجة واستخدام المؤخر من غيض من زوج مغلق من مقص لخرف بلطف الدهنية على طول السفينة للافراج عن الخلايا الدهنية. عندما تم جمع جميع الخلايا تخلص من قطع كبيرة من الأنسجة الليفية وتزن الدهون المشذبة.
لمزيد من الإفراج عن الخلايا من الأنسجة الدهنية، ونقل 10 غراما من الأنسجة الدهنية في جديد 15 سم طبق بيتري واستخدام مقص منحني ل mince بعناية الدهون حتى يصبح خليط متجانس على نحو سلس مع عدم وجود قطع كبيرة من الدهنية. عندما تم معالجة جميع الدهون، واستخدام ملعقة لنقل 10 ملليلتر من الأنسجة المفروم في أنابيب 50 ملليلتر الفردية وإضافة 30 ملليلتر من عازلة الهضم إلى كل أنبوب. ثم ضع الأنابيب في حاضنة تهتز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و 150 دوران في الدقيقة لمدة 30 إلى 35 دقيقة.
اكتمال عملية الهضم عندما يكون الحل الدهني متجانسًا ، وملونًا بالمشمش ، وتغيب عن القطع الكبيرة. في نهاية عملية الهضم، decant محلول الدهون المهضمة في مرشح شبكة 250 ميكرومتر داخل قمع مجموعة في قارورة لتر واحد معقمة. عندما تم التملص من حجم كامل من تعليق adipocyte، لطيف الضغط على مرشح شبكة لزيادة العائد من adipocytes وغسل مرشح مع 50 إلى 100 ملليلتر من عازلة الغسيل قبل الضغط على مرشح مرة أخرى.
نقل حل adipocyte معزولة في قمع فصل وإضافة العازلة غسيل حتى يتم ملء القمع تماما تقريبا. عكس بلطف القمع عدة مرات لخلط تعليق adipocyte مع العازلة والسماح للتعليق الوقوف لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يكون هناك فصل واضح من الطبقات. عندما تكون الطبقات قد فصلت، فتح فوهة على القمع وتهرب ببطء حل أسفل في قارورة عقيمة.
عندما تم إزالة كل من collagenase، وجمع محلول adipocyte ناضجة تنقية في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر وتعبئة طفيفة الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم، استخدام حقنة 10 ملليلتر مجهزة إبرة قياس 18 لإزالة المخزن المؤقت الغسيل المتبقية تحت تعليق aococyte واستخدام ماصة لإزالة طبقة الدهون الحرة العائمة فوق adipocytes ناضجة. لبذات من adipocytes ناضجة، ضع الغشاء نفاذية إدراج مكون رأسا على عقب على سطح معقم وعكس بلطف أنابيب adipocytes معبأة عدة مرات لضمان توزيع الخلايا بالتساوي.
باستخدام طرف ماصات تتحمل واسعة، إضافة 30 ميكرولترات من adipocytes ناضجة معبأة على كل غشاء. عكس لوحة إدراج في حركة واحدة على نحو سلس بحيث تكون adipocytes مبذر في الجزء السفلي من إدراج. ضع لوحة إدراج في 24 لوحة البئر التي تحتوي على 500 إلى 1، 000 ميكرولترس كاملة 37 درجة مئوية متوسطة في البئر.
ثم، تغطية لوحة ووضع بعناية لوحة في حاضنة ثقافة الأنسجة. كل سبعة أيام من الثقافة، واستبدال المتوسطة عن طريق ثقب انقطاع في كل إدراج. بعد أسبوع واحد من الثقافة، المجاميع الدهنية الناضجة المعزولة من الأنسجة الدهنية تحت الجلد الحفاظ على مورفولوجيا الدهون أحادية الموقع المميزة لوحظ فقط في adipocytes ناضجة.
العلاج مع ناهضات PPAR-GAMMA pioglitazone وrosiglitazone النتائج في زيادة التعبير في الجينات تستجيب PPAR-غاما، في حين أن العلاج مع ناهض مستقبلات جلوكوكورتيرويد ديكساميثاسون ليس له أي تأثير على هذه الجينات. وبالمثل، فإن ناهض مستقبلات الجلوكوكورتيكويد يدفع بقوة التعبير الجيني للجينات المستهدفة لمستقبلات الجلوكوكورتيكويد، في حين أن ناهضي PPAR-GAMMA ليس لهم أي آثار كبيرة على هذه الجينات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العلاج لمدة سبعة أيام مع ناهضات PPAR-GAMMA يحفز بقوة التعبير الجيني للجين المحدد للدهون البنية ، UCP1.
يمكن استخدام نموذجنا الجديد للشحميلات في المختبر للدراسات الوظيفية في الخلايا الدهنية الناضجة ، بما في ذلك امتصاص الجلوكوز ، و lipogenesis ، و lipolysis. مع هذه التقنية الجديدة ثقافة adipocyte كنا قادرين على إظهار أن البشرة البيضاء الناضجة البشرية يمكن أن تفرّق إلى adipocytes البني مثل.
