Eine Herausforderung auf dem Gebiet der Fettbiologie bestand darin, die Reife in der Kultur aufrechtzuerhalten. Wir haben eine neue Methode entwickelt, die es ermöglicht, langfristige Adipozyten während großer Veränderungen zu untersuchen. Unsere Adipozytenkulturtechnik ermöglicht das Studium von Zellwechselwirkungen und wird hoffentlich für die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden für Diabetes und Adipositas nützlich sein.
Es ist wichtig, das Protokoll sorgfältig zu befolgen, da es einige kritische Schritte gibt, die die Genqualität und die Lebensfähigkeit der reifen Adipozyten stark beeinflussen. Stellen Sie beispielsweise vor der Beschichtung sicher, dass der gesamte freie Lipid- und Waschpuffer entfernt wurde, da sonst die Lipozyten abreißen könnten, wenn die Einsätze invertiert werden. Nach Erhalt der menschlichen subkutanen Fettgewebeprobe legen Sie das Gewebe in einem sterilen biologischen Sicherheitsschrank in eine 15 Zentimeter lange Petrischale.
Ein kleines Volumen von mittel 199 zum Gericht. Verwenden Sie eine Pinzette, um große fibrotische Gefäße im Gewebe zu erfassen und verwenden Sie die Rückseite der Spitze einer geschlossenen Schere, um die Fettigkeit entlang des Gefäßes sanft zu verschrotten, um die Adipozyten freizusetzen. Wenn alle Zellen gesammelt wurden, entsorgen Sie die großen Stücke von fibrotischem Gewebe und wiegen das getrimmte Fett.
Um die Zellen weiter aus dem Fettgewebe freizusetzen, übertragen Sie 10 Gramm Fettgewebe in eine neue 15 Zentimeter lange Petrischale und verwenden Sie eine gekrümmte Schere, um das Fett sorgfältig zu zerkleinern, bis es zu einer glatten homogenen Mischung ohne große Fettstücke wird. Wenn das gesamte Fett verarbeitet ist, verwenden Sie einen Löffel, um 10 Milliliter Hackfleisch in einzelne 50-Milliliter-Röhren zu übertragen und 30 Milliliter Verdauungspuffer in jede Röhre hinzuzufügen. Dann legen Sie die Rohre in einem Schüttel-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 150 Umdrehungen pro Minute für 30 bis 35 Minuten.
Die Verdauung ist abgeschlossen, wenn die Fettlösung homogen, Aprikosen gefärbt und von großen Stücken fehlt. Am Ende der Verdauung dekantieren Sie die verdaute Fettlösung in einen 250 Mikrometer Maschendrahtfilter in einem Trichter, der in einen sterilen Ein-Liter-Kolben gesetzt ist. Wenn das gesamte Volumen der Adipozytensuspension entweicht ist, drücken Sie den Netzfilter sanft, um die Ausbeute an Adipozyten zu erhöhen, und waschen Sie den Filter mit 50 bis 100 Milliliter Waschpuffer, bevor Sie den Filter erneut drücken.
Die isolierte Adipozytenlösung in einen Trenntrichter geben und Waschpuffer hinzufügen, bis der Trichter fast vollständig gefüllt ist. Um die Adipozytenaufhängung mit dem Puffer zu mischen und die Suspension zwei bis drei Minuten lang stehen zu lassen, bis die Schichten deutlich getrennt sind, wird der Trichter vorsichtig umgedreht. Wenn sich die Schichten getrennt haben, öffnen Sie die Düse auf dem Trichter und entziehen Sie sich langsam der Bodenlösung in einen sterilen Kolben.
Wenn die gesamte Kollagenase entfernt wurde, sammeln Sie die gereinigte reife Adipozytenlösung in 50 Milliliter konischen Röhrchen und verpacken Sie die Zellen leicht durch Zentrifugation. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 18-Meter-Nadel ausgestattet ist, um den verbleibenden Waschpuffer unterhalb der Adipozytensuspension zu entfernen, und verwenden Sie eine Pipette, um die freie Lipidschicht zu entfernen, die über den reifen Adipozyten schwebt. Für die Aussaat der reifen Adipozyten, legen Sie die durchlässige Membraneinsatzkomponente auf eine sterile Oberfläche und invertieren Sie die Rohre verpackter Adipozyten ein paar Mal, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
Mit einer breit bohrungen Pipettenspitze 30 Mikroliter verpackter reifer Adipozyten auf jede Membran geben. Invertieren Sie das Insert-Panel in einer glatten Bewegung, so dass sich die gesäten Adipozyten auf der Unterseite der Einsätze befinden. Legen Sie die Packung mit Deninlagen in eine 24-Well-Platte mit 500 bis 1.000 Mikroliter n. B. 37 Grad Celsius pro Brunnen.
Dann bedecken Sie die Platte und legen Sie die Platte vorsichtig in einen Gewebekultur-Inkubator. Alle sieben Tage Kultur, ersetzen Sie das Medium über das Ausschnittloch in jedem Einsatz. Nach einer Woche Kultur erhalten reife Adipozytenaggregate, die aus subkutanem Fettgewebe isoliert sind, die charakteristische unilokulare Lipidtröpfchenmorphologie, die nur in reifen Adipozyten beobachtet wird.
Die Behandlung mit den PPAR-GAMMA-Agonisten Pioglitazon und Rosiglitazon führt zu einer erhöhten Expression in PPAR-GAMMA-reaktionsfähigen Genen, während die Behandlung mit dem Glukokortikoid-Rezeptor-Agonisten-Dexamethason keinen Einfluss auf diese Gene hat. In ähnlicher Weise treibt der Glukokortikoid-Rezeptor-Agonist robust die Genexpression von Glukokortikoid-Rezeptor-Zielgenen an, während die PPAR-GAMMA-Agonisten keine signifikanten Auswirkungen auf diese Gene haben. Darüber hinaus induziert eine siebentägige Behandlung mit den PPAR-GAMMA-Agonisten robust die Genexpression des braunen fettspezifischen Gens, UCP1.
Unser neues Adipozyten-In-vitro-Modell kann für die funktionellen Studien in reifen Adipozyten, einschließlich Glukoseaufnahme, Lipogenese und Lipolyse, verwendet werden. Mit dieser neuen Adipozytenkulturtechnik konnten wir zeigen, dass menschliche reife weiße Adipozyten in braune Adipozyten transdifferenzieren können.
