Un desafío en el campo de la biología adiposa ha sido mantener el adipocitos maduros en la cultura. Hemos desarrollado un nuevo método que permite el estudio del adipocitos a largo plazo a lo largo de grandes cambios. Nuestra técnica de cultivo de adipocitos permite el estudio de las interacciones celulares y con suerte será útil para el desarrollo de nuevos tratamientos para la diabetes y la obesidad.
Es importante seguir el protocolo cuidadosamente, ya que hay algunos pasos críticos que afectan en gran medida la calidad del gen y la viabilidad de los adipocitos maduros. Por ejemplo, antes del enchapado asegúrese de que todos los lípidos libres y el tampón de lavado se han eliminado de lo contrario los lipocitos podrían arrancar cuando las inserciones están invertidas. Después de recibir la muestra de tejido adiposo subcutáneo humano, coloque el tejido en un gabinete de seguridad biológica estéril en una placa Petri de 15 centímetros.
Un pequeño volumen de 199 medio al plato. Utilice pinzas para agarrar grandes vasos fibrosos dentro del tejido y utilice la parte posterior de la punta de un par de tijeras cerradas para raspar suavemente el adipose a lo largo del vaso para liberar los adipocitos. Cuando se hayan recogido todas las células, deseche las grandes piezas de tejido fibroso y pese la grasa recortada.
Para liberar aún más las células del tejido graso, transfiera 10 gramos de tejido adiposo a una nueva placa Petri de 15 centímetros y utilice tijeras curvas para picar cuidadosamente la grasa hasta que se convierta en una mezcla homogénea lisa sin grandes trozos de adiposo. Cuando se haya procesado toda la grasa, utilice una cuchara para transferir 10 mililitros de tejido picado a tubos individuales de 50 mililitros y agregue 30 mililitros de tampón de digestión a cada tubo. A continuación, coloque los tubos en una incubadora de temblores a 37 grados centígrados y 150 rotaciones por minuto durante 30 a 35 minutos.
La digestión se completa cuando la solución adiposa es homogénea, de color albaricoque y ausente de piezas grandes. Al final de la digestión, decantar la solución de grasa digerida en un filtro de malla de 250 micrómetros dentro de un embudo colocado en un matraz estéril de un litro. Cuando se haya eludido todo el volumen de suspensión de adipocitos, apriete suavemente el filtro de malla para aumentar el rendimiento de los adipocitos y lave el filtro con 50 a 100 mililitros de tampón de lavado antes de apretar el filtro de nuevo.
Transfiera la solución de adipocitos aisladas a un embudo de separación y agregue el búfer de lavado hasta que el embudo esté casi completamente lleno. Invierta suavemente el embudo varias veces para mezclar la suspensión del adipocitos con el tampón y deje reposar la suspensión durante dos o tres minutos hasta que haya una separación distinta de las capas. Cuando las capas se hayan separado, abra la boquilla en el embudo y eluda lentamente la solución inferior en un matraz estéril.
Cuando se haya eliminado toda la colagenasa, recoja la solución de adipocitos maduros purificados en tubos cónicos de 50 mililitros y empaque ligeramente las células por centrifugación. A continuación, utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18 para quitar el tampón de lavado restante debajo de la suspensión del adipocitos y utilice una pipeta para eliminar la capa de lípidos libres que flota por encima de los adipocitos maduros. Para la siembra de los adipocitos maduros, coloque el componente de inserción de membrana permeable boca abajo en una superficie estéril e invierta suavemente los tubos de adipocitos embalados varias veces para asegurar una distribución uniforme de las células.
Usando una punta de pipeta de diámetro ancho, agregue 30 microlitros de adipocitos maduros envasados en cada membrana. Invierta el panel de inserción en un movimiento suave para que los adipocitos de semillas estén en la parte inferior de las plaquitas. Coloque el panel de plaquitas en una placa de 24 pozos que contenga 500 a 1.000 microlitros de medio celsius completo de 37 grados por pozo.
A continuación, cubra el plato y coloque cuidadosamente el plato en una incubadora de cultivo de tejido. Cada siete días de cultivo, reemplace el medio a través del orificio de corte en cada plaquita. Después de una semana de cultivo, los agregados de adipocitos maduros aislados del tejido adiposo subcutáneo mantienen la morfología característica de las gotas lipídicas uniloculares observada sólo en adipocitos maduros.
El tratamiento con los agonistas PPAR-GAMMA pioglitazona y rosiglitazona da como resultado un aumento de la expresión en los genes sensibles PPAR-GAMMA, mientras que el tratamiento con la dexametasona agonista agonista del receptor de glucocorticoides no tiene ningún efecto sobre estos genes. Del mismo modo, el agonista del receptor glucocorticoides impulsa robustamente la expresión génica de los genes diana del receptor de glucocorticoides, mientras que los agonistas PPAR-GAMMA no tienen efectos significativos en estos genes. Además, el tratamiento de siete días con los agonistas PPAR-GAMMA induce robustamente la expresión génica del gen específico de la grasa marrón, UCP1.
Nuestro nuevo modelo in vitro de adipocitos se puede utilizar para los estudios funcionales en adipocitos maduros, incluyendo la absorción de glucosa, lipogénesis y lipólisis. Con esta nueva técnica de cultivo de adipocitos hemos sido capaces de mostrar que los adipocitos blancos maduros humanos pueden transdiferenciarse en adipocitos marrones.
