RT-PCRs קונבנציונליים אינם מאפשרים אפליה בין רצפי החושים והאנטי-חושיים כאשר נעשה בהם שימוש כדי לזהות RNAs המקודדים על ידי גנים חופפים. פרוטוקול זה מאפשר לזהות RNAs אנטי-חושיים במיוחד. השימוש פריימרים biotynylated יחד עם טמפרטורות denaturation RNA גבוה מאפשר הגברה של cDNAs אנטי חושי, מניעת היווצרות של מוצרי RT לא ספציפיים.
השתמשנו בשיטה זו כדי להדגים כי ASP או כמו אנטי חוש RNA או מבשר חלבון, זה אנטיגן HIV חדש, עושה את זה פוטנציאל יעד HIV חדשני לטיפול. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת, שבה ניתן לזהות RNAs אנטי-חושיים מגנים חופפים. התחל בתכנון פריימרים ספציפיים למטופל באמצעות רצף הדנ"א הפרו-ויראלי הפנימי של פריימרים PanASP.
לאחר מכן, לכמת את RNA ולמנוע זיהום DNA על ידי טיפול בדגימות עם DNase. העבר בין 0.1 ומיקרוגרם אחד של RNA הכולל לתוך בארות המתאימות על צלחת PCR 96 היטב. לאחר מכן להגדיר את התמלול ההפוך, או תגובת RT, על פי הוראות כתב היד.
הכן את פקדי RT אנדוגניים על ידי הוספת חמישה microliters של מים חופשיים גרעין במקום פריימר הפוך ASP. מכניסים את הצלחת לתרמוצ'ילר ומחממים את ה-RNA ל-94 מעלות במשך חמש דקות. ואז מיד לקרר אותו במים קרים לפחות דקה אחת.
הכן את תערובת התגובה בצינור 1.5 מיליליטר כמתואר בכתב היד טקסט, ולאחר מכן להעביר 17.5 microliters לכל אחד RNA המכיל בארות. דנטורציה RNA חייב להתבצע ב 94 מעלות צל"ש. ללא denaturation מוחלט, סינתזות של מוצרים לא ספציפיים מן RNA החוש עלול להתרחש, המוביל הגברה של cDNAs לא ספציפי.
מערבבים בעדינות את תכולת הבאר ומטמיבים את הצלחת ב-55 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. לאחר מכן, להשבית את התגובות על ידי חימום הצלחת ל 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הכינו ליטר אחד של כביסה פי 2 וחוצץ מחייב לפי הוראות כתב היד וסננים את הפתרון.
לאחר מכן, הכינו 50 מיליליטר של כביסה פי 1 ומאגר מחייב באמצעות מים בדרגת PCR. מעבירים את המספר המתאים של חרוזים מגנטיים נדנים לצינור 1.5 מיליליטר ואז שוטפים אותם על ידי הוספת נפח שווה של שטיפת פי 2 ומאגר קשירה ומערבולת הצינור למשך 15 שניות. מניחים את הצינור לתוך מתלה הפרדה מגנטית להדרור אותו במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, להסיר בזהירות את supernatant מבלי להפריע את חרוזים ולהוסיף את אותו נפח של 2X כביסה חיץ מחייב כמו הנפח הראשוני של חרוזים. Vortex את חרוזים במשך 30 שניות ולהעביר 10 microliters של ההשעיה למספר מתאים של צינורות 1.5 מיליליטר. מניחים את הצינורות במתלה ההפרדה המגנטית ומדרגרים אותם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, השליכו את העל-טבעי והוסיפו 50 מיקרוליטרים של חיץ כביסה וכריכה 2X. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של cDNA biotynylated לצינורות המתאימים עם חרוזים דגירה אותם במשך 30 דקות תוך סיבוב בעדינות. לאחר הדגירה, מניחים את הצינורות על מתלה ההפרדה המגנטית במשך שלוש דקות ואז לשטוף את חרוזים עם 200 microliters של 1X כביסה חיץ מחייב, ואחריו דגירה שלוש דקות על מתלה ההפרדה.
השליכו את העל-טבעי וחזרו על הכביסה פעמיים. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בחרוזים ב-10 מיקרוליטרים של מים בדרגת PCR. הכן כרך מתאים של PCR מאסטר מיקס בהתאם לכיווני כתב היד.
מערבבים אותו היטב במהירות לסובב אותו, ולאחר מכן להעביר 49 microliters לגם לצלחת PCR 96 היטב. בזהירות מערבולת הצינורות עם cDNA מטוהרים במשך 15 שניות ולהוסיף מיקרוליטר אחד של ההשעיה ל בארות המתאימות. הפעל את PCR ולהפריד את המוצרים על 1%agarose ג'ל.
חותכים את הרצועות מהג'ל ומשכפלים את המוצרים המוגברים לפלסמיד PCR 2.1. לאחר מכן לרצף את השיבוטים ולנתח כל רצף. התגובות הראשוניות של RT בוצעו עם פריימר אנטי-חושי רגיל שאינו ביוטיני, והביאו להגברה מוצלחת של ASP.
עם זאת, רצועה של אותו משקל מולקולרי ופקדי פרימר מינוס הוגברה גם היא. כדי לעקוף בעיה זו, פריימר אנטי חוש ספציפי היה שכותרתו עם biotyn ואת cDNA אנטי חוש וכתוצאה מכך היה מטוהר לפני PCR. זה אפשר להגביר את רצף ASP עם זיהום מופחת מאוד מן cDNA לא ספציפי בפקדי פרימר מינוס.
אופטימיזציה נוספת של שיטה זו הושגה על ידי denaturation מלא של RNA ב 94 מעלות צלזיוס לפני RT, ואחריו קירור מיידי על מי קרח, אשר הביא הגברה יעילה של הלהקה ASP ולא מוצרים שאינם ספציפיים. הקינטיקה של ASP RNA נמדדו ותאי CD4 מבודדים משלושה נבדקים נשאי HIV עם וירמיה הניתנת לגילוי והיעדר טיפול בעקבות גירוי עם אנטי CD3/CD28. כימות של ASP RNA היה אפשרי גם בחולים שעברו אמנות, עם וירמיה שאינה ניתנת לגילוי.
בשניים מתוך שלושה חולים, ASP RNA זוהה ברמות נמוכות ב שלושה עד חמישה ימים לאחר גירוי. שני חולים נותחו עבור ASP ו ENV RNAs, אחד מטופל ואחד מטופל. עבור המטופל שלא טופל, ניתן היה לזהות את שני ה- RNAs.
עבור המטופל המטופל המטופל, ASP ו env בקושי היו ניתנים לגילוי לאחר מספר ימים של גירוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי denaturation ליניארית RNA כך מבנים משניים מסוגלים ראש RT נהרסים. בעוד, שטיפת חרוזים שוטף משם cDNAs שאינם biotynylated.
לאחר טיהור ה- cDNAs עם הקוטביות הנכונה, ניתן לבצע qPCR כדי לנתח ביטוי גנים. יתר על כן, cDNAs ניתן גם לשכפל ושמש לניתוח רצף. שיטה זו מאפשרת ללמוד גנים חופפים בכיוון ההפוך ועשויים להיות שימושיים בהבהרת רגולציה ופתוגנזה של חיידק ומחלות הקשורות לנגיף כולל סוגים מסוימים של סרטן.
