אנו מודים לד&quot;ר רוג&#39;ר אריקסון על תמיכתו וסיוע בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן במכונים הלאומי לבריאות (גרנט מספר RO1CA177984; RO1CA138642), פרויקט תכנית VA בסרטן הערמונית (BX001604).

קבוע פורמלין, משובץ פרפין (FFPE) או דגימות סרטן ערמונית קפואים התקבלו מSFVAMC. דגימות מחולי סרטן הערמונית שעברו כריתה רדיקלית של ערמונית בSFVAMC. נכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל החולים והמחקר אושר על ידי ועדת קליפורניה בסן פרנסיסקו על מחקר אנושי. לחלופין, microarrays רקמות סרטן הערמונית היו רכש ממקורות מסחריים ומשמש למירנה ניתוחים על ידי איש. מידע Clinicopathological ומעקב לחולי סרטן ערמונית ניתחו נאסף. 1. דגימות רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך דגימות רקמת סרטן ערמונית לסעיפים 10 מיקרומטר באמצעות microtome וכתם עם H &amp; E הבאה הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקור שקופיות צבעוניות לזיהוי מוקדי סרטן ערמונית כמו גם אפיתל בלוטות נורמלי סמוך. הערה: הפתולוג לוח מוסמך לבחון את השקופיות ואמא H &amp; E מוכתמותRK לגידול ואזורים נורמלים. השתמש בשקופיות סומנו כמדריכים בסעיפים הבאים למירנה ניתוחים מגידול לעומת אזורים נורמלים. </li></ol> 2. ניתוח ביטוי מירנה על ידי בזמן אמת כמותי PCR הערה: זרימת עבודה זו כוללת את השלבים הבאים: microdissection לייזר לכידת, בידוד של רנ&quot;א הכל (כולל מירנה וmRNA), assaying של miRNAs הבוגר באמצעות מבחני ביטוי TaqMan MicroRNA כמפורט בסעיפים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של מירנה מערמונית רקמות FFPE סרטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microdissection ללכוד לייזר (LCM) הערה: בצע את השלבים 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 במנדף כימי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופיות רקמה (10 מיקרומטר חלקים) לLCM. סעיפי רקמות Deparrafinize על ידי השרייה בקסילן (2x), במשך 10 דקות כל אחד, אז רעננות הרקמות על ידי דוגרים השקופיות עבור 5 דקות כל אחד באתנול מדורג (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) ואחריו מזוקק מים(5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התייבשות, קטעי כתם עם hematoxylin למשך 30 שניות ואחריו מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מקום באתנול מדורג (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 דקות כל אחד) וקסילן (5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות יבשים במנדף ולאחר מכן למקם במכשיר LCM לmicrodissection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע microdissections עם מערכת LCM בהתאם להוראות היצרן 24. פתולוג השימוש מסומן שקופיות כמדריכים לזיהוי מוקדי סרטן ערמונית, כמו גם הרקמה נורמלית סמוכה. השתמש בקרן הלייזר בקוטר 10-20 פעימות מיקרומטר עם כוח של 70-90 mW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורי לכידתו של עניין עם פעימות לייזר אינפרא-אדומים על כובעי LCM. לשלב תאים 2-5 כמוסות להפקת מירנה לדגימה. כדי להבטיח את השלמות של RNA חילוץ, מייד לעבד תאים שנתפסו להפקת מירנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, תאי lyse במאגר חילוץ מירנה (על פי הפרוטוקול של היצרן) וSTOמחדש lysates ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מירנה הפקה וניתוח מרקמות microdissected LCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ RNA המוחלט מרקמות microdissected FFPE באמצעות ערכה מסחרית הבאה הוראות היצרן. הערה: התשואה של רנ&quot;א מmiscrodissection לכידת לייזר היא בדרך כלל נמוכה. לכן, RNA הוא eluted להיקפים נמוכים (20-30 μl) ומשמש לפרופיל ביטוי באמצעות מבחני ביטוי TaqMan microRNA הבאים הוראות יצרן (גם מתואר בסעיף 2.2). אופטימיזציה של RNA קלט בזמן אמת איתור PCR של miRNAs הבוגר עולה כי 5 μl של רנ&quot;א eluted הוא אופטימלי עבור כל תגובת שעתוק לאחור מירנה ספציפית. כשליטת אנדוגני, משמש RNU48 / RNU24. לתגובות שליטה, 2 μl של רנ&quot;א eluted משמש לתגובת השעתוק לאחור. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של מירנה מערמונית רקמות קפואות סרטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize קפוא רקמות ערמונית כריתה על ידי שחיקה הרקמות בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי. העבר את הרקמה הומוגני לצינור microcentrifuge בעזרת מרית מקוררת. לשמור מרגמה / העלי ומרית באותה הטמפרטורה על ידי טבילה ברקמה כל כך הומוגני חנקן נוזלי ניתן להעביר בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מגיב guanidine המסחרית isothiocyanate-פנול (1 מיליליטר / 0.1 גרם של רקמה) לרקמה הומוגני ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. הערה: רקמות הומוגני במגיבה isothiocyanate-פנול guanidine המסחרית יכולות להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כלורופורם לhomogenate (0.2 מיליליטר כלורופורם / מיליליטר) ולנער במרץ למשך 30 שניות. דגירה דגימות ב RT במשך 3-5 דקות ואחריו צנטריפוגה ב 10,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב העליון המימי לצינור 1.5 מיליליטר טרי סטרילי RNase ללא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של אלכוהול איזופרופיל. לערבב דגירה במשך 10 מילn ב RT ואחריו צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עד גלולה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולשטוף את גלולה RNA עם 1 מ&quot;ל של אתנול 70%. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant. כדורים יבשים RNA ב RT למשך 5-10 דקות. לפזר RNA ב50-100 nuclease ללא מים μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כימות של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר nanodrop ולקבוע שלמות RNA עם bioanalyzer. התאם ריכוזי RNA עד 10 ng / μl. השתמש 10-50 RNA ng לתגובת cDNA הספציפי miRNA- אחרי זמן אמת PCR ניתוחים (סעיף 2.2). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR בזמן אמת כמותי לניתוח ביטוי מירנה הערה: miRNAs הבוגר Assay באמצעות פרוטוקול RT-PCR שני שלבים כמפורט להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תמלול (RT) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לתמלל cDNA מ- RNA באמצעות ערכת שעתוק לאחור מירנה בהתאם להוראות היצרן.השתמש 10-50 ננוגרם של רנ&quot;א הכל עם פריימר הספציפי מירנה מערכת מבחני MicroRNA וRT. השתמש RNU48 / RNU24 / RNU6B שולטת. לדלל cDNA 1: 5 ל01:10 (תלוי בשפע של מירנה ניתחה) ולהשתמש בזיהוי PCR בזמן אמת כפי שמתוארת בשלב הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן אמת PCR לאיתור של מבוגרים מירנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר מוצרי ה- PCR מדגימות cDNA באמצעות מבחני MicroRNA עם תערובת אמן אוניברסלית מהירה בהתאם להוראות יצרן. לנרמל דגימות לRNU48 / RNU24 / שליטת RNU6B. השתמש בשיטה ההשוואתית CT (מחזור סף) כדי לחשב את השינויים יחסי בביטוי גנים במערכת ה- PCR בזמן אמת מהירה. לנתח כל דגימה בשלושת עותקים. </li></ol></li></ol></li></ol> ניתוח ביטוי 3. מירנה על ידי באתרו הכלאה (עורך) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום טיפול ברקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 5 מיקרומטר חלקים מלוקי רקמת סרטן ערמונית FFPE באמצעות microtome. </li><lאני&gt; תקן סעיפי רקמות על ידי דוגרים השקופיות על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הערה: ניתן לאחסן שקופיות ב RT במשך כמה שבועות למירנה ניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparrafinize הרקמות על ידי שריה השקופיות עם קסילן (2x), במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננות הרקמות על ידי דוגרים השקופיות עבור 5 דקות כל אחד באתנול מדורג (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) ואחריו מים מזוקקים (5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את השקופיות עם paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם PBS (2x) בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את השקופיות עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר proteinase K ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות במאגר K proteinase המחומם מראש (5 טריס-HCL מ&quot;מ pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 מ&quot;מ NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טיפול proteinase-K, לשטוף את השקופיות עם גליצין 0.2% ב PBS למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות בPBS (1X) בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את השקופיות עם Paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות יש לשטוף עםPBS במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להכליא את השקופיות עם פתרון הכלאה מראש במשך 3-4 שעות על 55 מעלות צלזיוס בתא humidified. השתמש במגבוני מעבדה רקמה ספוגים ב- 50% SSC פוראמיד / 50% 5x כדי לשמור על התא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5 בדיקות &quot;שכותרתו digoxigenin בריכוז של 20-50 ננומטר במאגר הכלאה. לדלל בדיקה מירנה ספציפית (20-50 ננומטר) ובדיקה קטנה RNA הגרעיני שליטת U6 (20 ננומטר), חום ב -90 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, מניח אותו על קרח, ולהוסיף למאגר הכלאת קרח קר (2-4 ng / μl ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון הכלאה מראש, להוסיף פתרון הכלאה (בדיקה + חיץ הכלאה, לכל שקופית 100 μl), דגירה של 12-16 שעות בטמפרטורת הכלאת בדיקה ספציפית (טמפרטורת הכלאה = בדיקה-21 Tm מעלות צלזיוס). לבצע הכלאות בתא humidified (50% פוראמיד / 50% SSC 5x). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלבי כביסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם 2x SSC במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף tהוא מחליק עם SSC 1.5x במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם SSC 0.2X (2x) על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות עם פתרון חסימת 1x במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות עם 1: 100 PBS בדילול נוגדן אנטי digoxigenin AP-מצומדות ל1-4 שעות או הלילה בשעת 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם PBS (3x) בטמפ &#39;החדר למשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות (2x) עם אלקליין phosphatase חיץ (100 מ&quot;מ טריס pH 9.5, 50 מ&quot;מ MgCl 2, 100 מ&quot;מ NaCl, Tween-20 0.1%) ב RT במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות במצע BM הסגול AP בחושך ב RT עבור 1-20 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות עם PBS המכיל 0.1% Tween-20 ולשטוף (2x) במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות באמצעות תקשורת הרכבה מימית ולבחון תחת מיקרוסקופ. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li><li>Shen, M. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+prostate+cancer:+new+prospects+for+old+challenges.">Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges.</a> Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).</li><li>Sequeiros, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+for+prostate+cancer+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).</li><li>Cary, K. C., Cooperberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+in+prostate+cancer+surveillance+and+screening:+past,+present,+and+future.">Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future.</a> Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).</li><li>Sartori, D. A., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+in+prostate+cancer:+what's+new.">Biomarkers in prostate cancer: what's new.</a> Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li><li>Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mammalian+microRNA+host+genes+and+transcription+units.">Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units.</a> Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).</li><li>Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+III+transcribes+human+microRNAs.">RNA polymerase III transcribes human microRNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).</li><li>Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microRNAs+are+processed+from+capped,+polyadenylated+transcripts+that+can+also+function+as+mRNAs.">Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs.</a> RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+genes+are+transcribed+by+RNA+polymerase+II.">MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II.</a> EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).</li><li>Bartel, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+prostate+cancer:+from+biomarkers+to+molecularly-based+therapeutics.">MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics.</a> Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).</li><li>Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastamir:+the+field+of+metastasis-regulatory+microRNA+is+spreading.">Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading.</a> Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).</li><li>Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet,+microRNAs+and+prostate+cancer.">Diet, microRNAs and prostate cancer.</a> Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).</li><li>Saini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+Role+of+mir-203+in+Prostate+Cancer+Progression+and+Metastasis.">Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis.</a> Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).</li><li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+signatures+from+the+small+non-coding+RNA+transcriptome+in+prostate+cancer.">Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer.</a> Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).</li><li>Porkka, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+prostate+cancer.">MicroRNA expression profiling in prostate cancer.</a> Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).</li><li>Schaefer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+implications+of+microRNA+profiling+in+prostate+carcinoma.">Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma.</a> Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).</li><li>Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+microRNAs+in+prostate+cancer+and+therapeutic+opportunities.">Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities.</a> Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).</li><li>Xi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+microRNA+expression+of+RNA+extracted+from+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples.">Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples.</a> RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).</li><li>Lucas, S. M., Heath, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+in+development+of+differentially+expressed+and+prognostic+prostate+cancer+biomarkers.">Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers.</a> Prostate Cancer. , 640968 (2012).</li><li>Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Novel+Bicyclo[2.2.1]+Ribonucleosides:+2'-Amino-+and+2'-Thio-LNA+Monomeric+Nucleosides.">Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides.</a> J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).</li><li>Suh, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-145+is+regulated+by+DNA+methylation+and+p53+gene+mutation+in+prostate+cancer.">MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer.</a> Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).</li><li>Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+in+prostate+cancer+research:+establishment+and+validation+of+a+powerful+tool+for+the+assessment+of+tumour-stroma+interactions.">Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions.</a> BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).</li><li>Nelson, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain.">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).</li><li>Hanna, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+microRNAs+in+tissue+microarrays+by+in+situ+hybridization.">Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization.</a> Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).</li></ol>

The authors have no financial disclosures.

במאמר זה, אנו מתארים זרימת עבודה פשוטה לביטוי מירנה פרופיל בFFPE ארכיון או רקמות קליניות בסרטן הערמונית קפואים. בסרטן הערמונית, מספר מחקרים מצביעים על תפקיד חשוב של מיקרו-רנ&quot;א בסרטן ערמונית ייזום, התקדמות וגרורות. עם זאת, תוצאות סותרות לעתים קרובות מתקבלות על 22...

הסרטן של בלוטת הערמונית הוא גידול ממאיר נפוצה זכר אובחן כי הוא אחד הגורמים עיקריים לתמותה מהסרטן הקשורים בקרב גברים. בארה&quot;ב, מוערך 220800 מקרים חדשים ו27540 מקרי מוות ידווחו בשנת 2015 1. סרטן הערמונית הוא מחלה הטרוגנית עם מחלה משתנה מאוד כמובן את הגידולים יכולים להיות עצלים או מאוד אגרסיביים. אתגר קריטי בניהול קליני בסרטן הערמונית הוא שמציב את חוסר ההתאמה של שיטות המשמשים כיום / סמנים ביולוגיים להקרנת מחלה, אבחון, הפרוגנוזה וטיפול 2. שיטות הקרנה נוכחית כוללות אנטיגן ספציפי לערמונית בדיקה (PSA) ובדיקה רקטלית דיגיטלית (DRE) ואחריו ביופסיות ערמונית 3. אנטיגן הספציפי לערמונית (PSA) הוא הסמן הביולוגי לסרטן הערמונית הנפוץ ביותר שיש מהפכה ניהול ושיעורי הישרדות משופרת 4 קליניים משמעותי. עם זאת, בשל מגבלות מובנות של Lac PSA כוללk של סגוליות, הקרנה מבוססת ה- PSA הוביל לעל אבחון ועל טיפול במחלה. לאור זאת, מאמצים אינטנסיביים מתבצעים מכוונים חיפוש עבור סמנים לסרטן הערמונית חלופיים, במיוחד אלה שיכולים לחזות את האגרסיביות של המחלה וקבלת החלטות טובות יותר לטיפול 4,5. בשנים האחרונות, מיקרו RNA (miRNAs) צמחו כסמנים לסרטן הערמונית חלופיים מבטיחים. מיקרו RNA (miRNAs) מהווה כיתה אבולוציונית שימור של RNAs קידוד שאינו קטן המדכאים ביטוי גנים לאחר תעתיק באמצעות אינטראקציות רצף ספציפי עם 3&#39;- האזורים מתורגמים (UTRs) של מטרות mRNA מקור. הערכה היא כי&gt; 60% של mRNAs נשמרים מטרות של miRNAs 6. גני מירנה ממוקמים באזורי intergenic או בתוך אינטרונים או אקסונים חלבון / חלבון שאינו של קידוד גנים 7. גנים אלה עיבד מועדף על ידי RNA פולימראז II לפרימהmiRNAs ר&quot;י (פרי-miRNAs, ארוך כמה קילו-בסיס) שמבנים משניים גזע לולאה בצורת סיכת ראש הטופס. פרי-miRNAs אלה מעובדים לmiRNAs המבשר (טרום miRNAs, ארוך 60-75 נוקלאוטיד) שמיוצאים לציטופלסמה ועיבוד נוסף לmiRNAs הבוגר (18-25 נוקליאוטידים ארוך) 8-10. miRNAs לווסת תהליכים תאיים מרכזיים, כולל התפשטות, פיתוח, בידול ואפופטוזיס 11. מחקרים מראים חוסר ויסות נרחבת של פרופילי ביטוי מירנה בגידולים ממאירים אנושיים שונים, כוללים סרטן הערמונית 12-15. פרופילי ביטוי מירנה כבר דיווחו להיות dysregulated נרחב בסרטן הערמונית גרורתי ראשוני ו. ביטוי שינה מירנה נקשר עם התקדמות סרטן הערמונית, תוקפנות והישנות המדגישה את הפוטנציאל פרוגנוסטיים של miRNAs 12,14,16-19. גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שmiRNAs לשחק תפקידים מכניסטית חשובים בייזום סרטן הערמונית, פיתוח, התקדמותיון וגרורות. בסך הכל, miRNAs הם מתעוררים סמנים ביולוגיים חלופיים מבטיחים כלאבחון סרטן הערמונית והפרוגנוזה שיכול להבחין בין רקמות וסיוע נורמלים וסרטן בריבוד של גידולי ערמונית 12. כמו כן, miRNAs הם מטרות חשובות לפיתוח תרופות יעילות נגד סרטן הערמונית 20. בשל גודלם הקטן והתנגדות לפעילות RNase אנדוגני, miRNAs הם סמנים ביולוגיים יציבים שניתן לאתר בקלות ברקמות-קבוע פורמלין 21 ובביופסיות ערמונית 22. יתר על כן, פרופילי הביטוי של miRNAs כבר לעומת ברקמות קפואות ופורמלין קבוע ונמצאו להיות מתואמים חזק 21. עם זאת, ביטוי מירנה פרופיל ברקמות קליניות בסרטן הערמונית הוא לעתים קרובות מאתגר בשל ההטרוגניות גידול, טעויות דגימה, זיהום וכו &#39;סטרומה הפיתוח של miRNAs כסמנים ביולוגיים יעילים לסרטן הערמונית רלי כבדותes על זיהוי מדויק שלהם ברקמות קליניות. כאן אנו מתארים זרימת עבודה פשוטה המשמשת במעבדה שלנו לביטוי מירנה פרופיל בFFPE ארכיון או דגימות קליניות בסרטן הערמונית קפואים. אנו מעסיקים שילוב של זמן אמת כמותי PCR וכלאה באתר למירנה ניתוחים של דגימות קליניות, עם המידע לשעבר מניב כמותית נוספת והאחרון להמחשת ביטוי ההפרש של סמנים ביולוגיים מירנה פוטנציאליות במערך של רקמות. בתוך זרימת עבודה זו, אנו לייעל את השיטות הקיימות להפקת מירנה מFFPE ורקמות ערמונית קפוא, ביטוי מנתח ידי TaqMan-בדיקה מירנה RT-PCR ומירנה בטכניקת הכלאה באתר מבוסס באמצעות חומצות גרעין נעולים (LNA) מבוסס בדיקות 23. בדיקות מבוססות LNA מציעות רגישות וסגוליות מוגברות בהשוואה לדנ&quot;א או בדיקות המבוססות RNA- ומאפשרת זיהוי חזק של כל רצפי מירנה, ללא קשר לתוכן GC שלהם וגם לאפשר discrimination של משפחות מירנה. פרוטוקול מירנה ISH מותאם שלנו יכול להיות מיושם על שקופיות סרטן ערמונית רקמות או microarrays רקמות סרטן הערמונית (TMA), עם האחרונים מציע את הפוטנציאל להאצת גילוי סמן ביולוגי מירנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus Autopix for LCM</td>
			<td>Arcturus/ Life Technologies</td>
			<td>LCM1621/LCM1110</td>
			<td>Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real Time PCR System&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Universal PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG labeled LNA probe for U6</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>99002-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM Purple AP substrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-hybridization solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-conjugated anti-digoxigenin antibody</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>H-5501&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>SL200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>SL201&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues

אתגר קריטי בסרטן ערמונית ניהול קליני (PCA) הוא שמציב את חוסר ההתאמה של סמנים ביולוגיים המשמשים כיום להקרנת מחלה, אבחון, הפרוגנוזה וטיפול. בשנים האחרונות, מיקרו RNA (miRNAs) צמחו סמנים ביולוגיים חלופיים מבטיחים כלאבחון סרטן הערמונית והפרוגנוזה. עם זאת, הפיתוח של miRNAs כסמנים ביולוגיים יעילים לסרטן הערמונית מסתמך במידה רבה על זיהוי מדויק שלהם ברקמות קליניות. מירנה ניתוחים בדגימות קליניות בסרטן הערמונית הוא לעתים קרובות מאתגרת בשל ההטרוגניות גידול, טעויות דגימה, זיהום וכו &#39;סטרומה מטרתו של מאמר זה היא לתאר את זרימת עבודה פשוטה למירנה הניתוחים בFFPE ארכיון או דגימות קליניות בסרטן הערמונית קפואים באמצעות שילוב של בזמן אמת PCR (RT-PCR) וכלאה באתר (עורך). בתוך זרימת עבודה זו, אנו לייעל את השיטות הקיימות להפקת מירנה מFFPE וtissu ערמונית קפואהes וביטוי מנתחים ידי TaqMan-בדיקה מירנה RT-PCR מבוסס. בנוסף, אנו מתארים שיטה מותאמת לISH מנתחת זיהוי formiRNA ברקמות ערמונית באמצעות חומצת גרעין נעול (LNA) - בדיקות מבוססות. פרוטוקול מירנה ISH מותאם שלנו יכול להיות מיושם על שקופיות סרטן ערמונית רקמות או microarrays רקמות סרטן הערמונית (TMA).

פרופיל ביטוי של miR-203 בדגימות קליניות בסרטן הערמונית העיקרית LCM על ידי RT-PCR ניתוחים (איור 1) RT-PCR ניתוחי ביטוי ביחס miR-203 ברקמות סרטן ערמונית העיקרית LCM והאזורים הסמוכים נורמלי ההתאמה בוצעו כפי שתואר בסאיני et al. 15 RNU4...

Watch this Scientific Journal Video about miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues at JoVE.com

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K Views.  University of California San Francisco. Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Video: miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Cancer development is a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor cells, immune cells, fibroblasts and endothelial cells. Each type of cells undergoes signaling and functional changes during carcinogenesis. The current challenge for many cancer researchers is to dissect these changes in each cell type during the multiple-step process in vivo. In the last few years, the authors have developed a set of procedures to isolate different cell populations during skin cancer development using K14creER/R26-SmoM2YFP mice. The procedure is divided into 6 parts: 1) generating appropriate mice for the study (K14creER+ and R26-SmoM2YFP+ mice in this protocol); 2) inducing SmoM2YFP expression in mouse skin; 3) preparing mouse skin biopsies; 4) isolating epidermis from skin; 5) preparing single cells from epidermis; 6) labeling single cell populations for flow cytometry analysis. Generation of sufficient number of mice with the right genotype is the limiting step in this protocol, which may take up to two months. The rest of steps take a few hours to a few days. Within this protocol, we also include a section for troubleshooting. Although we focus on skin cancer, this protocol may be modified to apply for other animal models of human diseases.

Carcinogenesis is a process involving interactions between cancer cells and the cancer microenvironment. To dissect the molecular events, one needs to isolate different cell populations at different stages during cancer development. Using a mouse model for basal cell carcinoma, we describe a protocol for cell analyses during carcinogenesis.

ניתוח אוכלוסיית תאים בעור Carcinogenesis

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR הדמיה המולקולרית של סרטן הערמונית עם חומר ניגוד ממוקד המולקולרי קטן CLT1 פפטיד

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

זיהוי מבוסס microarray של פרט HERV לוקוסים ביטוי: בקשה לגילוי סמן ביולוגי בסרטן הערמונית

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2-&#916;&#916;ct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients&#039; Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.

ניתוח מירנה Exosomal ב non-small cell סרטן ריאות (NSCLC) מטופלים פלזמה באמצעות qPCR: כלי ביופסיה נוזלי ריאלי

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...