Name: mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר רוג&#39;ר אריקסון על תמיכתו וסיוע בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן במכונים הלאומי לבריאות (גרנט מספר RO1CA177984; RO1CA138642), פרויקט תכנית VA בסרטן הערמונית (BX001604).

קבוע פורמלין, משובץ פרפין (FFPE) או דגימות סרטן ערמונית קפואים התקבלו מSFVAMC. דגימות מחולי סרטן הערמונית שעברו כריתה רדיקלית של ערמונית בSFVAMC. נכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל החולים והמחקר אושר על ידי ועדת קליפורניה בסן פרנסיסקו על מחקר אנושי. לחלופין, microarrays רקמות סרטן הערמונית היו רכש ממקורות מסחריים ומשמש למירנה ניתוחים על ידי איש. מידע Clinicopathological ומעקב לחולי סרטן ערמונית ניתחו נאסף. 1. דגימות רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך דגימות רקמת סרטן ערמונית לסעיפים 10 מיקרומטר באמצעות microtome וכתם עם H &amp; E הבאה הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקור שקופיות צבעוניות לזיהוי מוקדי סרטן ערמונית כמו גם אפיתל בלוטות נורמלי סמוך. הערה: הפתולוג לוח מוסמך לבחון את השקופיות ואמא H &amp; E מוכתמותRK לגידול ואזורים נורמלים. השתמש בשקופיות סומנו כמדריכים בסעיפים הבאים למירנה ניתוחים מגידול לעומת אזורים נורמלים. </li></ol> 2. ניתוח ביטוי מירנה על ידי בזמן אמת כמותי PCR הערה: זרימת עבודה זו כוללת את השלבים הבאים: microdissection לייזר לכידת, בידוד של רנ&quot;א הכל (כולל מירנה וmRNA), assaying של miRNAs הבוגר באמצעות מבחני ביטוי TaqMan MicroRNA כמפורט בסעיפים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של מירנה מערמונית רקמות FFPE סרטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microdissection ללכוד לייזר (LCM) הערה: בצע את השלבים 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 במנדף כימי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופיות רקמה (10 מיקרומטר חלקים) לLCM. סעיפי רקמות Deparrafinize על ידי השרייה בקסילן (2x), במשך 10 דקות כל אחד, אז רעננות הרקמות על ידי דוגרים השקופיות עבור 5 דקות כל אחד באתנול מדורג (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) ואחריו מזוקק מים(5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התייבשות, קטעי כתם עם hematoxylin למשך 30 שניות ואחריו מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מקום באתנול מדורג (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 דקות כל אחד) וקסילן (5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות יבשים במנדף ולאחר מכן למקם במכשיר LCM לmicrodissection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע microdissections עם מערכת LCM בהתאם להוראות היצרן 24. פתולוג השימוש מסומן שקופיות כמדריכים לזיהוי מוקדי סרטן ערמונית, כמו גם הרקמה נורמלית סמוכה. השתמש בקרן הלייזר בקוטר 10-20 פעימות מיקרומטר עם כוח של 70-90 mW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורי לכידתו של עניין עם פעימות לייזר אינפרא-אדומים על כובעי LCM. לשלב תאים 2-5 כמוסות להפקת מירנה לדגימה. כדי להבטיח את השלמות של RNA חילוץ, מייד לעבד תאים שנתפסו להפקת מירנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, תאי lyse במאגר חילוץ מירנה (על פי הפרוטוקול של היצרן) וSTOמחדש lysates ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מירנה הפקה וניתוח מרקמות microdissected LCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ RNA המוחלט מרקמות microdissected FFPE באמצעות ערכה מסחרית הבאה הוראות היצרן. הערה: התשואה של רנ&quot;א מmiscrodissection לכידת לייזר היא בדרך כלל נמוכה. לכן, RNA הוא eluted להיקפים נמוכים (20-30 μl) ומשמש לפרופיל ביטוי באמצעות מבחני ביטוי TaqMan microRNA הבאים הוראות יצרן (גם מתואר בסעיף 2.2). אופטימיזציה של RNA קלט בזמן אמת איתור PCR של miRNAs הבוגר עולה כי 5 μl של רנ&quot;א eluted הוא אופטימלי עבור כל תגובת שעתוק לאחור מירנה ספציפית. כשליטת אנדוגני, משמש RNU48 / RNU24. לתגובות שליטה, 2 μl של רנ&quot;א eluted משמש לתגובת השעתוק לאחור. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של מירנה מערמונית רקמות קפואות סרטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize קפוא רקמות ערמונית כריתה על ידי שחיקה הרקמות בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי. העבר את הרקמה הומוגני לצינור microcentrifuge בעזרת מרית מקוררת. לשמור מרגמה / העלי ומרית באותה הטמפרטורה על ידי טבילה ברקמה כל כך הומוגני חנקן נוזלי ניתן להעביר בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מגיב guanidine המסחרית isothiocyanate-פנול (1 מיליליטר / 0.1 גרם של רקמה) לרקמה הומוגני ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. הערה: רקמות הומוגני במגיבה isothiocyanate-פנול guanidine המסחרית יכולות להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כלורופורם לhomogenate (0.2 מיליליטר כלורופורם / מיליליטר) ולנער במרץ למשך 30 שניות. דגירה דגימות ב RT במשך 3-5 דקות ואחריו צנטריפוגה ב 10,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב העליון המימי לצינור 1.5 מיליליטר טרי סטרילי RNase ללא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של אלכוהול איזופרופיל. לערבב דגירה במשך 10 מילn ב RT ואחריו צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עד גלולה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולשטוף את גלולה RNA עם 1 מ&quot;ל של אתנול 70%. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant. כדורים יבשים RNA ב RT למשך 5-10 דקות. לפזר RNA ב50-100 nuclease ללא מים μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כימות של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר nanodrop ולקבוע שלמות RNA עם bioanalyzer. התאם ריכוזי RNA עד 10 ng / μl. השתמש 10-50 RNA ng לתגובת cDNA הספציפי miRNA- אחרי זמן אמת PCR ניתוחים (סעיף 2.2). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR בזמן אמת כמותי לניתוח ביטוי מירנה הערה: miRNAs הבוגר Assay באמצעות פרוטוקול RT-PCR שני שלבים כמפורט להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תמלול (RT) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לתמלל cDNA מ- RNA באמצעות ערכת שעתוק לאחור מירנה בהתאם להוראות היצרן.השתמש 10-50 ננוגרם של רנ&quot;א הכל עם פריימר הספציפי מירנה מערכת מבחני MicroRNA וRT. השתמש RNU48 / RNU24 / RNU6B שולטת. לדלל cDNA 1: 5 ל01:10 (תלוי בשפע של מירנה ניתחה) ולהשתמש בזיהוי PCR בזמן אמת כפי שמתוארת בשלב הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן אמת PCR לאיתור של מבוגרים מירנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר מוצרי ה- PCR מדגימות cDNA באמצעות מבחני MicroRNA עם תערובת אמן אוניברסלית מהירה בהתאם להוראות יצרן. לנרמל דגימות לRNU48 / RNU24 / שליטת RNU6B. השתמש בשיטה ההשוואתית CT (מחזור סף) כדי לחשב את השינויים יחסי בביטוי גנים במערכת ה- PCR בזמן אמת מהירה. לנתח כל דגימה בשלושת עותקים. </li></ol></li></ol></li></ol> ניתוח ביטוי 3. מירנה על ידי באתרו הכלאה (עורך) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום טיפול ברקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 5 מיקרומטר חלקים מלוקי רקמת סרטן ערמונית FFPE באמצעות microtome. </li><lאני&gt; תקן סעיפי רקמות על ידי דוגרים השקופיות על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הערה: ניתן לאחסן שקופיות ב RT במשך כמה שבועות למירנה ניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparrafinize הרקמות על ידי שריה השקופיות עם קסילן (2x), במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננות הרקמות על ידי דוגרים השקופיות עבור 5 דקות כל אחד באתנול מדורג (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) ואחריו מים מזוקקים (5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את השקופיות עם paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם PBS (2x) בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את השקופיות עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר proteinase K ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות במאגר K proteinase המחומם מראש (5 טריס-HCL מ&quot;מ pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 מ&quot;מ NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טיפול proteinase-K, לשטוף את השקופיות עם גליצין 0.2% ב PBS למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות בPBS (1X) בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את השקופיות עם Paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות יש לשטוף עםPBS במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להכליא את השקופיות עם פתרון הכלאה מראש במשך 3-4 שעות על 55 מעלות צלזיוס בתא humidified. השתמש במגבוני מעבדה רקמה ספוגים ב- 50% SSC פוראמיד / 50% 5x כדי לשמור על התא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5 בדיקות &quot;שכותרתו digoxigenin בריכוז של 20-50 ננומטר במאגר הכלאה. לדלל בדיקה מירנה ספציפית (20-50 ננומטר) ובדיקה קטנה RNA הגרעיני שליטת U6 (20 ננומטר), חום ב -90 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, מניח אותו על קרח, ולהוסיף למאגר הכלאת קרח קר (2-4 ng / μl ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון הכלאה מראש, להוסיף פתרון הכלאה (בדיקה + חיץ הכלאה, לכל שקופית 100 μl), דגירה של 12-16 שעות בטמפרטורת הכלאת בדיקה ספציפית (טמפרטורת הכלאה = בדיקה-21 Tm מעלות צלזיוס). לבצע הכלאות בתא humidified (50% פוראמיד / 50% SSC 5x). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלבי כביסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם 2x SSC במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף tהוא מחליק עם SSC 1.5x במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם SSC 0.2X (2x) על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות עם פתרון חסימת 1x במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות עם 1: 100 PBS בדילול נוגדן אנטי digoxigenin AP-מצומדות ל1-4 שעות או הלילה בשעת 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם PBS (3x) בטמפ &#39;החדר למשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות (2x) עם אלקליין phosphatase חיץ (100 מ&quot;מ טריס pH 9.5, 50 מ&quot;מ MgCl 2, 100 מ&quot;מ NaCl, Tween-20 0.1%) ב RT במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות במצע BM הסגול AP בחושך ב RT עבור 1-20 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות עם PBS המכיל 0.1% Tween-20 ולשטוף (2x) במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות באמצעות תקשורת הרכבה מימית ולבחון תחת מיקרוסקופ. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li><li>Shen, M. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+prostate+cancer:+new+prospects+for+old+challenges.">Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges.</a> Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).</li><li>Sequeiros, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+for+prostate+cancer+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).</li><li>Cary, K. C., Cooperberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+in+prostate+cancer+surveillance+and+screening:+past,+present,+and+future.">Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future.</a> Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).</li><li>Sartori, D. A., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+in+prostate+cancer:+what's+new.">Biomarkers in prostate cancer: what's new.</a> Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li><li>Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mammalian+microRNA+host+genes+and+transcription+units.">Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units.</a> Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).</li><li>Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+III+transcribes+human+microRNAs.">RNA polymerase III transcribes human microRNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).</li><li>Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microRNAs+are+processed+from+capped,+polyadenylated+transcripts+that+can+also+function+as+mRNAs.">Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs.</a> RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+genes+are+transcribed+by+RNA+polymerase+II.">MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II.</a> EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).</li><li>Bartel, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+prostate+cancer:+from+biomarkers+to+molecularly-based+therapeutics.">MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics.</a> Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).</li><li>Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastamir:+the+field+of+metastasis-regulatory+microRNA+is+spreading.">Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading.</a> Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).</li><li>Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet,+microRNAs+and+prostate+cancer.">Diet, microRNAs and prostate cancer.</a> Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).</li><li>Saini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+Role+of+mir-203+in+Prostate+Cancer+Progression+and+Metastasis.">Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis.</a> Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).</li><li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+signatures+from+the+small+non-coding+RNA+transcriptome+in+prostate+cancer.">Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer.</a> Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).</li><li>Porkka, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+prostate+cancer.">MicroRNA expression profiling in prostate cancer.</a> Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).</li><li>Schaefer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+implications+of+microRNA+profiling+in+prostate+carcinoma.">Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma.</a> Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).</li><li>Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+microRNAs+in+prostate+cancer+and+therapeutic+opportunities.">Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities.</a> Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).</li><li>Xi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+microRNA+expression+of+RNA+extracted+from+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples.">Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples.</a> RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).</li><li>Lucas, S. M., Heath, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+in+development+of+differentially+expressed+and+prognostic+prostate+cancer+biomarkers.">Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers.</a> Prostate Cancer. , 640968 (2012).</li><li>Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Novel+Bicyclo[2.2.1]+Ribonucleosides:+2'-Amino-+and+2'-Thio-LNA+Monomeric+Nucleosides.">Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides.</a> J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).</li><li>Suh, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-145+is+regulated+by+DNA+methylation+and+p53+gene+mutation+in+prostate+cancer.">MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer.</a> Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).</li><li>Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+in+prostate+cancer+research:+establishment+and+validation+of+a+powerful+tool+for+the+assessment+of+tumour-stroma+interactions.">Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions.</a> BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).</li><li>Nelson, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain.">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).</li><li>Hanna, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+microRNAs+in+tissue+microarrays+by+in+situ+hybridization.">Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization.</a> Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).</li></ol>

The authors have no financial disclosures.

במאמר זה, אנו מתארים זרימת עבודה פשוטה לביטוי מירנה פרופיל בFFPE ארכיון או רקמות קליניות בסרטן הערמונית קפואים. בסרטן הערמונית, מספר מחקרים מצביעים על תפקיד חשוב של מיקרו-רנ&quot;א בסרטן ערמונית ייזום, התקדמות וגרורות. עם זאת, תוצאות סותרות לעתים קרובות מתקבלות על 22...

הסרטן של בלוטת הערמונית הוא גידול ממאיר נפוצה זכר אובחן כי הוא אחד הגורמים עיקריים לתמותה מהסרטן הקשורים בקרב גברים. בארה&quot;ב, מוערך 220800 מקרים חדשים ו27540 מקרי מוות ידווחו בשנת 2015 1. סרטן הערמונית הוא מחלה הטרוגנית עם מחלה משתנה מאוד כמובן את הגידולים יכולים להיות עצלים או מאוד אגרסיביים. אתגר קריטי בניהול קליני בסרטן הערמונית הוא שמציב את חוסר ההתאמה של שיטות המשמשים כיום / סמנים ביולוגיים להקרנת מחלה, אבחון, הפרוגנוזה וטיפול 2. שיטות הקרנה נוכחית כוללות אנטיגן ספציפי לערמונית בדיקה (PSA) ובדיקה רקטלית דיגיטלית (DRE) ואחריו ביופסיות ערמונית 3. אנטיגן הספציפי לערמונית (PSA) הוא הסמן הביולוגי לסרטן הערמונית הנפוץ ביותר שיש מהפכה ניהול ושיעורי הישרדות משופרת 4 קליניים משמעותי. עם זאת, בשל מגבלות מובנות של Lac PSA כוללk של סגוליות, הקרנה מבוססת ה- PSA הוביל לעל אבחון ועל טיפול במחלה. לאור זאת, מאמצים אינטנסיביים מתבצעים מכוונים חיפוש עבור סמנים לסרטן הערמונית חלופיים, במיוחד אלה שיכולים לחזות את האגרסיביות של המחלה וקבלת החלטות טובות יותר לטיפול 4,5. בשנים האחרונות, מיקרו RNA (miRNAs) צמחו כסמנים לסרטן הערמונית חלופיים מבטיחים. מיקרו RNA (miRNAs) מהווה כיתה אבולוציונית שימור של RNAs קידוד שאינו קטן המדכאים ביטוי גנים לאחר תעתיק באמצעות אינטראקציות רצף ספציפי עם 3&#39;- האזורים מתורגמים (UTRs) של מטרות mRNA מקור. הערכה היא כי&gt; 60% של mRNAs נשמרים מטרות של miRNAs 6. גני מירנה ממוקמים באזורי intergenic או בתוך אינטרונים או אקסונים חלבון / חלבון שאינו של קידוד גנים 7. גנים אלה עיבד מועדף על ידי RNA פולימראז II לפרימהmiRNAs ר&quot;י (פרי-miRNAs, ארוך כמה קילו-בסיס) שמבנים משניים גזע לולאה בצורת סיכת ראש הטופס. פרי-miRNAs אלה מעובדים לmiRNAs המבשר (טרום miRNAs, ארוך 60-75 נוקלאוטיד) שמיוצאים לציטופלסמה ועיבוד נוסף לmiRNAs הבוגר (18-25 נוקליאוטידים ארוך) 8-10. miRNAs לווסת תהליכים תאיים מרכזיים, כולל התפשטות, פיתוח, בידול ואפופטוזיס 11. מחקרים מראים חוסר ויסות נרחבת של פרופילי ביטוי מירנה בגידולים ממאירים אנושיים שונים, כוללים סרטן הערמונית 12-15. פרופילי ביטוי מירנה כבר דיווחו להיות dysregulated נרחב בסרטן הערמונית גרורתי ראשוני ו. ביטוי שינה מירנה נקשר עם התקדמות סרטן הערמונית, תוקפנות והישנות המדגישה את הפוטנציאל פרוגנוסטיים של miRNAs 12,14,16-19. גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שmiRNAs לשחק תפקידים מכניסטית חשובים בייזום סרטן הערמונית, פיתוח, התקדמותיון וגרורות. בסך הכל, miRNAs הם מתעוררים סמנים ביולוגיים חלופיים מבטיחים כלאבחון סרטן הערמונית והפרוגנוזה שיכול להבחין בין רקמות וסיוע נורמלים וסרטן בריבוד של גידולי ערמונית 12. כמו כן, miRNAs הם מטרות חשובות לפיתוח תרופות יעילות נגד סרטן הערמונית 20. בשל גודלם הקטן והתנגדות לפעילות RNase אנדוגני, miRNAs הם סמנים ביולוגיים יציבים שניתן לאתר בקלות ברקמות-קבוע פורמלין 21 ובביופסיות ערמונית 22. יתר על כן, פרופילי הביטוי של miRNAs כבר לעומת ברקמות קפואות ופורמלין קבוע ונמצאו להיות מתואמים חזק 21. עם זאת, ביטוי מירנה פרופיל ברקמות קליניות בסרטן הערמונית הוא לעתים קרובות מאתגר בשל ההטרוגניות גידול, טעויות דגימה, זיהום וכו &#39;סטרומה הפיתוח של miRNAs כסמנים ביולוגיים יעילים לסרטן הערמונית רלי כבדותes על זיהוי מדויק שלהם ברקמות קליניות. כאן אנו מתארים זרימת עבודה פשוטה המשמשת במעבדה שלנו לביטוי מירנה פרופיל בFFPE ארכיון או דגימות קליניות בסרטן הערמונית קפואים. אנו מעסיקים שילוב של זמן אמת כמותי PCR וכלאה באתר למירנה ניתוחים של דגימות קליניות, עם המידע לשעבר מניב כמותית נוספת והאחרון להמחשת ביטוי ההפרש של סמנים ביולוגיים מירנה פוטנציאליות במערך של רקמות. בתוך זרימת עבודה זו, אנו לייעל את השיטות הקיימות להפקת מירנה מFFPE ורקמות ערמונית קפוא, ביטוי מנתח ידי TaqMan-בדיקה מירנה RT-PCR ומירנה בטכניקת הכלאה באתר מבוסס באמצעות חומצות גרעין נעולים (LNA) מבוסס בדיקות 23. בדיקות מבוססות LNA מציעות רגישות וסגוליות מוגברות בהשוואה לדנ&quot;א או בדיקות המבוססות RNA- ומאפשרת זיהוי חזק של כל רצפי מירנה, ללא קשר לתוכן GC שלהם וגם לאפשר discrimination של משפחות מירנה. פרוטוקול מירנה ISH מותאם שלנו יכול להיות מיושם על שקופיות סרטן ערמונית רקמות או microarrays רקמות סרטן הערמונית (TMA), עם האחרונים מציע את הפוטנציאל להאצת גילוי סמן ביולוגי מירנה.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems&amp;nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix for LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 Fast Real-time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR master mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>DIG labeled LNA probe for U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP substrate</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Pre-hybridization solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-1&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-2&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-8&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>AP-conjugated anti-digoxigenin antibody</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-7&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Aqueous mounting media&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>H-5501&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018&quot;&gt;15596-018&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&amp;nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues

אתגר קריטי בסרטן ערמונית ניהול קליני (PCA) הוא שמציב את חוסר ההתאמה של סמנים ביולוגיים המשמשים כיום להקרנת מחלה, אבחון, הפרוגנוזה וטיפול. בשנים האחרונות, מיקרו RNA (miRNAs) צמחו סמנים ביולוגיים חלופיים מבטיחים כלאבחון סרטן הערמונית והפרוגנוזה. עם זאת, הפיתוח של miRNAs כסמנים ביולוגיים יעילים לסרטן הערמונית מסתמך במידה רבה על זיהוי מדויק שלהם ברקמות קליניות. מירנה ניתוחים בדגימות קליניות בסרטן הערמונית הוא לעתים קרובות מאתגרת בשל ההטרוגניות גידול, טעויות דגימה, זיהום וכו &#39;סטרומה מטרתו של מאמר זה היא לתאר את זרימת עבודה פשוטה למירנה הניתוחים בFFPE ארכיון או דגימות קליניות בסרטן הערמונית קפואים באמצעות שילוב של בזמן אמת PCR (RT-PCR) וכלאה באתר (עורך). בתוך זרימת עבודה זו, אנו לייעל את השיטות הקיימות להפקת מירנה מFFPE וtissu ערמונית קפואהes וביטוי מנתחים ידי TaqMan-בדיקה מירנה RT-PCR מבוסס. בנוסף, אנו מתארים שיטה מותאמת לISH מנתחת זיהוי formiRNA ברקמות ערמונית באמצעות חומצת גרעין נעול (LNA) - בדיקות מבוססות. פרוטוקול מירנה ISH מותאם שלנו יכול להיות מיושם על שקופיות סרטן ערמונית רקמות או microarrays רקמות סרטן הערמונית (TMA).

פרופיל ביטוי של miR-203 בדגימות קליניות בסרטן הערמונית העיקרית LCM על ידי RT-PCR ניתוחים (איור 1) RT-PCR ניתוחי ביטוי ביחס miR-203 ברקמות סרטן ערמונית העיקרית LCM והאזורים הסמוכים נורמלי ההתאמה בוצעו כפי שתואר בסאיני et al. 15 RNU4...

Watch this Scientific Journal Video about miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues at JoVE.com

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K Views.  University of California San Francisco. Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Video: miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results in cancer regression. However, in a significant number of cases, the disease progresses to advanced, castration-resistant prostate cancer (CRPC), which has limited therapeutic options and is often aggressive. Distant metastasis is mostly observed at this stage of the aggressive disease. CRPC is treated by a second generation of AR pathway inhibitors that improve survival initially, followed by the emergence of therapy resistance. Neuroendocrine prostate cancer (NEPC) is a rare variant of prostate cancer (PCa) that often develops as a result of therapy resistance via a transdifferentiation process known as neuroendocrine differentiation (NED), wherein PCa cells undergo a lineage switch from adenocarcinomas and show increased expression of neuroendocrine (NE) lineage markers. In addition to the genomic alterations that drive the progression and transdifferentiation to NEPC, epigenetic factors and microenvironmental cues are considered essential players in driving disease progression. This manuscript provides a detailed protocol to identify the epigenetic drivers (i.e., small non-coding RNAs) that are associated with advanced PCa. Using purified microRNAs from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) metastatic tissues and corresponding serum-derived extracellular vesicles (EVs), the protocol describes how to prepare libraries with appropriate quality control for sequencing microRNAs from these sample sources. Isolating RNA from both FFPE and EVs is often challenging because most of it is either degraded or is limited in quantity. This protocol will elaborate on different methods to optimize the RNA inputs and cDNA libraries to yield most specific reads and high-quality data upon sequencing.

Therapy resistance often develops in patients with advanced prostate cancer, and in some cases, cancer progresses to a lethal subtype called neuroendocrine prostate cancer. Assessing the small non-coding RNA-mediated molecular changes that facilitate this transition would allow better disease stratification and identification of causal mechanisms that lead to development of neuroendocrine prostate cancer.

רצפי RNA קטן ללא קידוד מתוך פורמאלין-רקמות קבועות וסרום-אקסוזומים נגזרות מחולי סרטן הערמונית עמידים סירוס

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Cancer Research

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

זיהוי מבוסס microarray של פרט HERV לוקוסים ביטוי: בקשה לגילוי סמן ביולוגי בסרטן הערמונית

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

TMEM200A: אונקוגן חדשני המווסת EMT ו- PI3K/AKT בסרטן קיבה

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in common cancers by multiomics analysis and used in vitro cell cultures of gastric cells to verify the results. The expression of TMEM200A in several human cancer types was assessed using the RNA-seq data from the UCSC Xena database. Bioinformatic analysis revealed a potential role of TMEM200A as a diagnostic and prognostic biomarker. 
Cultures of normal gastric and cancer cell lines were grown and TMEM200A was knocked down. The expression levels of TMEM200A were measured by using quantitative real-time polymerase chain reaction and western blotting. In vitro loss-of-function studies were then used to determine the roles of TMEM200A in the malignant behavior and tumor formation of gastric cancer (GC) cells. Western blots were used to assess the effect of the knockdown on epithelial-mesenchymal transition (EMT) and PI3K/AKT signaling pathway in GC. Bioinformatic analysis showed that TMEM200A was expressed at high levels in GC. 
The proliferation of GC cells was inhibited by TMEM200A knockdown, which also decreased vimentin, N-cadherin, and Snai proteins, and inhibited AKT phosphorylation. The PI3K/AKT signaling pathway also appeared to be involved in TMEM200A-mediated regulation of GC development. The results presented here suggest that TMEM200A regulates the tumor microenvironment by affecting the EMT. TMEM200A may also affect EMT through PI3K/AKT signaling, thus influencing the tumor microenvironment. Therefore, in pan-cancers, especially GC, TMEM200A may be a potential biomarker and oncogene.

מחבר זרקור: חשיפת סמנים הקשורים למשפחת החלבונים הטרנסממברנליים בסרטן קיבה והשלכות על טיפולים ממוקדים 

Here, a protocol is presented in which multiple bioinformatic tools are combined to study the biological functions of TMEM200A in cancer. In addition, we also experimentally validate the bioinformatics predictions.

ניתוח מולטיומיקס של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן-סרטני

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

אופטימיזציה של וזמינותו הביטוי מבוסס-RNA מולטיפלקס באמצעות חומר ארכיוני של סרטן השד

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Bioengineering

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

רצפי RNA קטן ללא קידוד מתוך פורמאלין-רקמות קבועות וסרום-אקסוזומים נגזרות מחולי סרטן הערמונית עמידים סירוס

זיהוי מבוסס microarray של פרט HERV לוקוסים ביטוי: בקשה לגילוי סמן ביולוגי בסרטן הערמונית

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

ניתוח מולטיומיקס של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן-סרטני

ניתוח מולטיומיקס של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן-סרטני

ניתוח מולטיומיקס של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן-סרטני

אופטימיזציה של וזמינותו הביטוי מבוסס-RNA מולטיפלקס באמצעות חומר ארכיוני של סרטן השד

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA