שיטה זו משלבת את היכולת להכתים לחלבון קרום תוך שמירה על שלמות הממברנה וארכיטקטורה תת-תאית. אז זה באמת חזק עבור לוקליזציה מדויקת חלבון הקשורים קרום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת את השימוש בתג חזק לשיבוט גנטי, APEX2, עם שיטות מתקדמות בשימור תאי למיקרוסקופ אלקטרונים, כולל קריופיקציה והחלפת הקפאה.
יחד, אלה מאפשרים לוקליזציה מדויקת של חלבונים בתוך תא שמור היטב. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לנתח מנגנונים שבהם וירוסים משכפלים בתוך התא המארח. וירוסים לעיתים קרובות יחטפו חלבונים מארחים במהלך ערכת הזיהום שלהם.
וירוסים הם הגנומים הקטנים, אשר הם משתמשים כדי לשכפל בתוך תאים מארחים אלה. לאחרונה, הצלחנו בנתונים שלא פורסמו, לתייג חלבונים אלה באמצעות טכנולוגיה זו כדי להבין כיצד וירוסים לשכפל. טכניקה זו הוכיחה באמת קריטי במחקר שיתופי שנערך לאחרונה על רעלן חיידקי שגורם התמוטטות golgi.
באמצעות cryoAPEX, הצלחנו לאתר במדויק את הרעלן עם חתיכות גולגי מקוטע, משהו שהיה ממש קשה לראות אחרת באמצעות טכניקות immunofluorescence נורמלי. הדגמת טכניקה זו תהיה איליין Mihelc, סטודנט לתואר שני, ושותף מחקר, סטפני אנג'ל, מהמעבדות שלנו. לאחר זריעת תאי HEK293 בצלחת, להדביק את התאים עם APEX2 מתויג פלסמידים ביטוי יונקים באמצעות רגנט transfection על פי הוראות היצרן.
ב 12-15 שעות לאחר transfection, לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם PBS מהצלחת לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 x g במשך חמש דקות.
הסירו בזהירות את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור בשני מיליליטר של 2%glutaraldehyde ו-0.1 מאגר נתרן קסודילאט טוחן בטמפרטורת החדר של 7.4 pH. מניחים את הדגימה על קרח כדי דגירה במשך 30 דקות. לאחר מכן, גלולה המדגם ב 500 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לשטוף את גלולה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם שני מיליליטר של 0.1 מאגר נתרן קאודילאט טוחנת על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להסיר את העל-טבעי. כדי לבצע את התגובה peroxidase, לשטוף את גלולה על ידי השעיה מחדש בשלושה מיליליטר של פתרון DAB ואחריו גלולה ב 500 x g במשך חמש דקות.
לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולה בשלושה מיליליטר של פתרון DAB עם 5.88 מי חמצן מילימולרית. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. גלולה הופך בצבע חום בעליל, המציין את נוכחותו של מוצר תגובת DAB מסיס.
לאחר שטיפה שוב עם חיץ קקודילאט נתרן ב- DMEM, על פי כתב היד, להשעות מחדש את גלולת התא ב 500 microliters של פתרון cryoprotectant של DMEM המכיל 10% סרום חזיר עוברי ו 15% אלבומין סרום bovine. העבר את ההשעיה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מיליליטר. גלולה שוב, מעט להגדיל את מהירות הצנטריפוגה מ 500 x גרם.
להשליך את רוב supernatant, להבטיח כי מספיק נוזל נשאר כך גלולה לא להתייבש. פתיל משם כל נוזל שנותר מכדור התא באמצעות הפינה של לנגב מעבדה או מגבת נייר. תן לנוזל מספיק להישאר כי גלולה יוצרת הדבק, דומה בעקביות משחת שיניים.
שאף שניים עד שלושה מיקרוליטרים של גלולת התא והפקיד אותו על מנשא קרום. ממלאים את באר נושאת הממברנה לחלוטין, כך שמתח פני השטח יוצר כיפה קלה מלמעלה. החלק את מנשא הממברנה לתוך המחסנית ומאובטח.
מקם את המחסנית במחשב HPF שהוכנה והוכנה ולחץ על התחל להקפיא. שמירה על המחסניות שקועות בחנקן נוזלי, הסר את מנשא הממברנה מהמחסנית שלו. מניחים לתוך קפסולת פלסטיק ומ מניחים את קפסולת הפלסטיק לתוך Cryovial מלא חנקן נוזלי.
במכסה המנוע הכימי, להכין מיליליטר אחד לכל מדגם של הפתרון של 0.2% משקל לפי נפח חומצה טאנית ו 5% DI מים אצטון ב Cryovial. מניחים אותם לתוך חנקן נוזלי להקפיא. מניחים את תערובת החלפת ההקפאה בקבוקון אחד ואת Cryovials המכיל את כדורי התא הקפוא לתוך תא המדגם יחידות החלפת ההקפאה.
מעבירים את הקפסולה הפנימית המכילה את נושא הממברנה מבקבוקון החנקן הנוזלי לתוך הבקבוקון המתאים המכיל תערובת החלפת הקפאה אחת. התחל פרוטוקול החלפת הקפאה ב 90 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, להשהות את החלפת ההקפאה ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות עם אצטון כי כבר מקורר ל 90 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, במכסה המנוע הכימי, הכינו מיליליטר אחד לדגימה של פתרון של 1%osmium tetroxide, 0.2% אורניל אצטט, ו 5% DI מים אצטון ב Cryovial וממקמים אותם בחנקן נוזלי להקפיא. מניחים את Cryovials עם תערובת החלפת ההקפאה שתיים לתוך יחידת החלפת ההקפאה ולהעביר את הכמוסות מן לשטוף אצטון השלישי לתוך תערובת החלפת ההקפאה שני בקבוקונים. דגירה אותם להקפיא תחליפים לערבב שתיים במשך 72 שעות ב 90 מעלות צלזיוס, ואחריו התחממות הדרגתית לאפס מעלות צלזיוס מעל 12-18 שעות.
שמור על הטמפרטורה באפס מעלות צלזיוס ולהוסיף אצטון מקורר מראש לתוך הבקבוקונים לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. הכינו תערובת של שף לבחירתכם בסקילר פלסטיק בהתאם להוראות היצרן והוסיפו 2%4% ו-8% מהסרף לבקבוקונים כדי לטבול את הקפסולות. דגירה במשך שעתיים כל אחד באפס מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הדגירה ב-15%30%60%90% ו-100% שף רכיבים של A, B ו-D רק למשך ארבע שעות כל אחת בטמפרטורת החדר. לאחר 20 שעות, להכין תערובת של רכיבי שף A, B, C, ו- D דגירה במשך ארבע שעות. מניחים את נושאות הממברנה עם צד גלולת תא למעלה לתוך תבניות הטבעה שטוחות וממלאים בתערובת שרף A, B, C ו- D.Place אותם בתנור כדי להפוך לפולימריה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 24-36 שעות.
לאחר פולמריזציה, להסיר את אבני מן התבנית ולמקום את המדגם ב chuck האנכי של microtome אולטרה שבו ניתן לדמיין עם הגדלה. הפרד את נושא הממברנה מהבלוק על ידי שילוב של חנקן נוזלי על מנשא הממברנה כדי להפריד את המתכת מהפלסטיק, ושימוש בסכין גילוח כדי לסובב את שרף סביב נושאת הממברנה. כאשר מופרדים, בעדינות להרים את נושאת הממברנה, משאיר את כיפת גלולת התא על פני הבלוק.
מניחים את הבלוק עם גלולת התא החשוף הפונה כלפי מעלה בתבנית הטבעה שטוחה כי הוא קצת יותר עמוק מאשר התבנית הראשונה ולמלא עם רכיבי שרף A, B, C, ו D.Polymerize ב 60 מעלות צלזיוס במשך 24-36 שעות. חתוך את הבלוק סביב גלולת התא באמצעות סכין גילוח. ואז למקם את הבלוק בדגימה צ'אק על זרוע החיתוך של מיקרוטום אולטרה.
בעזרת סכין זכוכית או יהלום, חותכים את הבלוק לצורה טרפז המקיפה מקרוב את גלולת התא. השג 90 ננומטר חלקים דקים במיוחד של גלולת התא באמצעות סכין זכוכית או יהלום. בחר רצועת כלים של מקטעים ברשת TEM.
יבש את הרשת על-ידי ניקוי הקצה על פיסת נייר סינון ואחסן אותה בתיבת אחסון של רשת TEM. הר את הרשת על מחזיק TEM והצב את המחזיק במיקרוסקופ. השתמש Tecnai T12 ב 80 קילו-וולט להקרנת דגימות cryoAPEX.
רכוש תמונות של תאים ומבנים תת-תאיים בעלי עניין באמצעות תיוג APEX2. במחקר זה, הכנת המדגם בשיטות APEX מסורתיות הביאה לתיוג ברור של מבנים מאורגנים וחלקים של רטיקולום אנדופלסמי. בהגדלה גבוהה, הממברנות המוערמות נראו פרוע ופערים לא אחידים היו קיימים בין צפיפות קרום קונצנטרית, המציין שימור קרום לקוי וחילוץ השומנים.
המדגם שהוכן על ידי cryoAPEX היה גם תיוג מוגדר בבירור של מאורגן, חלקה מבנים רטיקולום אנדופלסמי, עם זאת, הממברנות היו חלקות ומקבילות מעט מאוד מיצוי השומנים נראה. ניתוח TEM של 90 ננומטר חלקים דקים גילה כי שמרי הנטינגטון אינטראקציה חלבון E היה נוכח ברחבי רקמולום אנדופלזמי היקפי, כמו גם את המעטפה הגרעינית. בנוסף, שמרי הנטינגטון אינטראקציה חלבון E צפיפות נפתרה לתוך מוקדים במים קבועים לאורך קרום הרטיקולום האנטופלסמי luminal.
שמרי הנטינגטון אינטראקציה חלבון E הפצה ו foci נראו גם מדגם מוכן עם קיבעון מסורתי והתייבשות. עם זאת, שיבוש קרום נרחב וחילוץ היו נוכחים, מה שהופך את המדגם תת אופטימלי. תיוג APEX2 בוצע באמצעות שלושה סמנים תאיים, מהם Mito-V5-APEX2 סיפק כתמים ספציפיים של המיטוכונדריה בלבד ו- CAAX-APEX2 הפיק כתמים ברורים של קרום הפלזמה בלבד.
שום תיוג לא נצפה באברונים תאיים. הכתמים עבור לומן golgi הוערך גם באמצעות סמן אלפא MAN2-APEX2 כמתואר בכתב היד המקורי שלנו Sengupta ואח '. בעקבות הליך זה, שיטות תלת מימדיות כגון טומוגרפיה אלקטרונים או מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת קרן יון ממוקדת עשויות להתבצע על מנת לחקור את התפלגות התלת מימד של חלבון מעניין.
רבים מהכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה הם רעילים, ולכן לפני השימוש, יש להתייעץ עם גיליונות נתוני בטיחות כדי להבטיח כי הכימיקלים מטופלים באמצעות ציוד מגן אישי תקין ונפטרים בהתאם להנחיות המוסדיות.
