פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה עוזר להבין את הפרמקוקינטיקה של אתנול בפיתוח עוברי זברה וזה יעזור לתקנן אתנול חשיפה משטרים במחקרים זברה. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים למדוד במהירות ובשכפול רמות אתנול במהלך התפתחות עוברית, במיוחד בעוברים שבהם אספקת הדם אינה זמינה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות על מערכות מודל אחרות, כמו גם גורמים סביבתיים אחרים בהנחה טכניקה נכונה והגדרת ציוד.
הייתי מצפה מאנשים המבצעים פרוטוקול זה בפעם הראשונה להיאבק עם המהירות הדרושה כדי למנוע אידוי אתנול במהלך עיבוד עובר. התחל בהעברת 10 עוברים עם נוזל עוברי נוסף לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המסומנים בקו בנפח של 250 מיקרוליטרים. מוסיפים מים לקו המילוי.
הכינו צינורות מיקרוצנטריפוגה נוספים לדגימות מנוונות. כדי להסיר את chorion, דגירה העוברים בצלחת פטרי 100 מילימטר עם שני מיליגרם למיליליטר של קוקטייל פרוטאז במדיית עובר במשך 10 דקות. בעדינות מערבל את המנה כל כמה דקות כדי לשבור את המקהלה.
לאחר שכל העוברים חופשיים מהבחירה, מוציאים אותם מקוקטייל הפרוטאז ושוטפים אותם פעמיים עם מדיה טרייה. ואז להעביר את העוברים לצלחת 100 מילימטר טרי. כאשר כל הדגימות מוכנות למדידת נפח, השתמש במיקרופייפאט P200 עם הקצה הקטן ביותר האפשרי כדי להסיר בזהירות את כל הנוזלים מרחבי העוברים.
לשקול את המים עם סולם עם פחות מ 0.1 מיליגרם דיוק, ולאחר מכן לקבוע את הנפח של 10 עוברים על ידי חיסור המשקל של המים שהוסרו מ 250 microliters. כדי לקבוע את הנפח של עובר יחיד, חלק את ההפרש ב- 10. אוספים את העוברים ממיכלי ההזדווגות ומ מניחים אותם בצלחת פטרי סטנדרטית של 100 מ"מ ואז דוגרים את המנה ב-28.5 מעלות צלזיוס.
בשש שעות לאחר ההפריה, מעבירים עד 100 עוברים לתבשיל חדש עם תקשורת עוברית ו-1%אתנול או מדיה בלבד. מכסים אך לא לאטום את צלחות פטרי ומ מניחים אותן באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות או עד שהן מגיעות ל-24 שעות לאחר ההפריה. השתמשו בשני מיקרופיפטים P200 מוגדרים ל-50 מיקרוליטרים ושאפו את תטגם קוקטייל הפרוטאז לאחד ומים לשנייה.
ואז במהירות למקם 10 עוברים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה זכוכית ולסגור את הכובע. חזור על תהליך זה עבור כל הדגימות להיבדק, פקדים ועוברים שטופלו באתנול. עבודה עם מדגם אחד בכל פעם, לפתוח במהירות את הכובע ולחושף את כל המדיה עובר שיורית עם micropipette P200 להגדיר 200 microliters.
במהירות אך בעדינות להוסיף ולהסיר את 50 microliters של מים, ולאחר מכן להוסיף את 50 microliters של קוקטייל פרוטאז ולסגור את מכסה הצינור. תן את המדגם לשבת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואז במהירות להוסיף 450 microliters של חמישה נתרן כלורי טוחן ולסגור את כובע הצינור. הומוגניזציה המדגם על ידי מערבולת במשך 10 דקות ולהעביר שני microliters של על טבעי לבקבוקון כרומטוגרפיה גז.
לאטום את הבקבוקון עם כובע polytetrafluoroethylene. לאחר השלמת שיטת האתחול, טען 436 אתנול SPME נוכחי שתיים עד חמש דקות של הפעלת RG. ספיד מתפריט השיטות בתוכנת הניתוח עבור כל מדגם ברשימת הדוגמיות.
מלאו את רשימת הדגימות החל מהאוויר, המים, וחמישה בקבוקי פרוטאז נתרן כלורי טוחנים. לאחר מכן הזן את תקני אתנול לפי סדר מ 0.3125 כדי 40 מילימולר. בצע את הסטנדרטים עם הסיבוב השני של החסר.
הזן את כל דגימות עובר הומוגני supernatant להיבדק מן הנמוך ביותר לריכוז אתנול החזוי הגבוה ביותר ולסיים על ידי הזנת סיבוב שלישי של כדורי סרק. מוסיפים את בקבוקוני כרומטוגרפיה גז לדגימה כדי שבו הדגימות הוזנו ולאפשר להם להתחמם במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן התחל את הפעלת הדוגמה באמצעות התוכנה.
לאחר השלמת כל הפעולות, הפעל את שיטת הכיבוי על-ידי הוספת דוגמה סופית ברשימת הדוגמיות והפעלת המתנה.meth. גבה את כל הנתונים שנרכשו במהלך הריצה לדוגמה. לאחר השלמת שיטת הכיבוי, לחץ על כרומטוגרמה פתוחה ולפתוח את התיקייה עם התוצאות.
דוגמאות משולבות באופן אוטומטי בתוכנית זו. בתוצאות, ודא שהפסגות הנכונות שולבו. לאחר שכל הדגימות אושרו, הדפס או יצא את התוצאות.
התווה את גובה השיא של תקני האתנול בגרף ולאחר מכן חשב את ערכי השיפוע, y-intercept וה- r בריבוע. השג את ערך האתנול עבור כל מדגם על-ידי חיסור גובה השיא של המדגם מחיתוך-y של התקנים וחלוקת ערך זה על-ידי שיפוע התקנים. כדי לחשב את ריכוז האתנול בעוברים, לחשב את גורם הדילול עבור כל מדגם ולהכפיל את ערך אתנול המדגם על ידי גורם דילול זה.
לבסוף, לחשב דגימות הפניה למדיה על ידי הכפלת ערך אתנול התקשורת על ידי גורם דילול של 10. כדי לחשב כראוי את ריכוזי האתנול העובריים, נמדדו כמויות העוברים הן בכוריון שלהם והן הוסרו מה chorion שלהם. בניתוח זה, העובר היווה 56% מהנפח הכולל בתוך המקהלה.
בהתבסס על עבודה שפורסמה בעבר, 73.6% שימשו כתכני המים העובריים עבור כל הניתוחים שהוצגו. זה הביא מים הכוללים 0.82 microliters של 1.1 microliters של נפח עוברי. מתוך נפח המים הכולל, 49% כלולים בעובר ו-51% נמצאים בנוזל החוץ-מבריוני.
לצורך ניתוח כרומטוגרפיה של גז, נותחו שתי קבוצות של 15 דגימות והתקשורת שבה טופלו נמדדו חמש פעמים לכל קבוצה. רמות אתנול התקשורת היו 143.6 מילימולר לקבוצה אחת ו 133.6 מילימולר לקבוצה 2. ריכוזי האתנול של העוברים היו בממוצע 63.5 מילימולרים ו-53.1 מילימולרים לקבוצות 1 ו-2 בהתאמה.
יחס של ריכוז אתנול עוברי לרמות התקשורת של אתנול עבור כל מדגם חושב. לקבוצה הראשונה היו 44% מרמות האתנול במדיה, בעוד שלקבוצה היו 40% מרמות האתנול התקשורתי. עוברי בקרה לא מטופלים נמדדו בריכוז אתנול תקשורתי אפס מילימולרי.
הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא כי עיבוד העוברים לניתוח GC כראוי הוא קריטי כמו אתנול הוא נדיף יהיה להתאדות במהירות. הדרך הטובה ביותר לבצע שלב זה מתוארת, אבל זה צריך להיות מתורגל לפתח זיכרון שריר תקין. הליך זה יסייע לתקנן משטרים לטיפול באתנול בזברהפיש ויאפשר לעבודה עתידית לנתח את המנגנונים הגנטיים והתאיים של טרטוגניות אתנית.
