このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の開発におけるエタノールの薬物動態を理解するのに役立ち、ゼブラフィッシュ研究におけるエタノール暴露体制の標準化に役立つため、重要である。私たちの技術の主な利点は、特に血液供給が利用できない胚において、研究者が胚発生中にエタノールレベルを迅速かつ再現的に測定できることです。この方法は、他のモデルシステムだけでなく、適切な技術や機器のセットアップを前提とした他の環境要因に簡単に適用することができます。
私は、このプロトコルを初めて実行する個人が、胚処理中のエタノール蒸発を防ぐために必要な速度に苦労することを期待します。余分な胚液を含む10個の胚を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、250マイクロリットルの体積でラインでマークします。塗りつぶしラインに水を追加します。
デコリオネートサンプル用の追加のマイクロ遠心分離管を準備します。絨毛を取り除くために、胚培地中のプロテアーゼカクテル1ミリリットル当たり2ミリグラムのペトリ皿に100ミリメートルのペトリ皿で胚を10分間インキュベートする。数分間おきに皿をそっと渦巻いてチョリオンを壊します。
すべての胚が絨毛を含まないと、プロテアーゼカクテルから取り出し、新鮮な培地で2回洗います。その後、胚を新鮮な100ミリメートル皿に移します。すべてのサンプルが体積測定の準備ができたら、可能な限り小さい先端を持つP200マイクロピペットを使用して、胚の周りからすべての液体を慎重に取り除きます。
精度が0.1ミリグラム未満のスケールで水の重量を量り、250マイクロリットルから除去された水の重量を差し引くことによって10個の胚の体積を決定する。単一胚の体積を決定するには、その差を10で割る。交配タンクから胚を収集し、標準的な100ミリメートルペトリ皿に入れ、28.5度で皿をインキュベートします。
受精後6時間で、胚培地と1%エタノールまたは培地だけで最大100個の胚を新しい皿に移す。ペトリ皿を覆うが、18時間、または受精後24時間に達するまで28.5度のインキュベーターに入れる。50マイクロリットルにセットされた2つのP200マイクロピペットを使用し、プロテアーゼカクテル溶液を1つに吸引し、2番目の水に吸引します。
その後、ガラスピペットを使用して1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に10個の胚を素早く入れ、キャップを閉じます。試験対象のすべてのサンプル、コントロールおよびエタノール処理胚に対してこのプロセスを繰り返します。一度に1つのサンプルで作業し、キャップを素早く開き、P200マイクロピペットを200マイクロリットルに設定して残っている胚培地をすべて吸引します。
50マイクロリットルの水を素早く静かに加えて取り除き、50マイクロリットルのプロテアーゼカクテルを加え、チューブキャップを閉めます。サンプルを室温で10分間座らせ、450マイクロリットルの塩化ナトリウムモル5個を素早く加え、チューブキャップを閉めます。10分間の渦で試料を均質化し、2マイクロリットルの上清をガスクロマトグラフィーバイアルに移します。
バイアルをポリテトラフルオロエチレンキャップで密封します。起動方法を完了した後、436の現在のSPMEエタノールを2〜5分間のRG実行をロードします。サンプルリストの各サンプルの分析ソフトウェアのメソッドメニューからメス。
空気、水、および5モル塩化ナトリウムプロテアーゼカクテルブランクから始まるサンプルリストを記入してください。その後、0.3125から40ミリモルの順にエタノール標準を入力します。ブランクの第2ラウンドで標準に従ってください。
最も低いエタノール濃度から最も高い予測エタノール濃度までテストされる全ての均質化胚上清サンプルを入力し、第3ラウンドのブランクに入ることによって終了する。サンプルが入力された順序でオートサンプラーにガスクロマトグラフィーバイアルを追加し、10〜15分間温めます。次に、ソフトウェアを使用してサンプル実行を開始します。
すべての実行が完了したら、サンプル リストに最終サンプルを追加し、standby.meth を実行して、シャットダウン方法をアクティブにします。サンプル実行中に取得したすべてのデータをバックアップします。シャットダウン方法が完了したら、クロマトグラムを開いてクリックし、結果を含むフォルダを開きます。
サンプルは自動的にこのプログラムに統合されます。結果では、正しいピークが統合されていることを確認します。すべてのサンプルが確認されたら、結果を印刷またはエクスポートします。
エタノール標準のピーク高さをグラフにプロットし、傾斜、y-切片、r の二乗値を計算します。標準の y-切片からサンプルのピーク高さを減算し、この値を標準の傾きで割ることにより、各サンプルのエタノール値を得る。胚中のエタノール濃度を計算するには、各サンプルの希釈係数を計算し、この希釈係数でサンプルエタノール値を乗算します。
最後に、メディアエタノール値に希釈係数10を掛けることで、媒体参照サンプルを計算します。胚エタノール濃度を適切に計算するために、その絨毛膜中およびそれらの絨毛から除去された胚の体積を測定した。この分析では、胚は絨毛膜内の総体積の56%を占めた。
以前に発表された研究に基づいて、73.6%が提示されたすべての分析の胚性水分含有量として使用されました。その結果、1.1マイクロリットルの胚体積の0.82マイクロリットルを含む水が得られた。総水量のうち、49%が胚に含まれ、51%が胚外液中である。
ガスクロマトグラフィー解析では、15個のサンプルと、それらが処理された培地の2つのグループを、1群につき5回測定して分析した。培地エタノールレベルは、グループ1に対して143.6ミリモル、グループ2に対して133.6ミリモルであった。胚のエタノール濃度は、グループ1と2の平均63.5ミリモルと53.1ミリモルであった。
各試料に対するエタノールの培地レベルに対する胚エタノール濃度の比率を算出した。グループ1は培地エタノールレベルの44%を有し、グループは培地エタノールレベルの40%を有していた。未処理の対照胚を、ゼロミリモル培地エタノール濃度で測定した。
この手順を試みる際に覚えておくべきことは、エタノールが揮発性であり、すぐに蒸発するので、GC分析のために胚を適切に処理することが重要であるということです。このステップを実行する最善の方法が記載されています, それは適切な筋肉のメモリを開発するために実践する必要があります.この手順は、ゼブラフィッシュのエタノール処理体制を標準化し、将来の研究がエタンの催奇性の遺伝的および細胞的メカニズムを解剖することを可能にする。
