Dieses Protokoll ist wichtig, weil es hilft, die Pharmakokinetik von Ethanol bei der Entwicklung von Zebrafischembryonen zu verstehen, und dies wird dazu beitragen, Ethanol-Expositionsregime in Zebrafischstudien zu standardisieren. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass sie es Forschern ermöglicht, den Ethanolspiegel während der embryonalen Entwicklung schnell und reproduzierbar zu messen, insbesondere in Embryonen, in denen keine Blutversorgung verfügbar ist. Diese Methode kann leicht auf andere Modellsysteme sowie andere Umweltfaktoren angewendet werden, die eine ordnungsgemäße Technik und Ausrüstungseinrichtung voraussetzt.
Ich würde erwarten, dass Personen, die dieses Protokoll zum ersten Mal durchführen, mit der Geschwindigkeit kämpfen, die notwendig ist, um die Verdunstung von Ethanol während der Embryoverarbeitung zu verhindern. Beginnen Sie mit der Übertragung von 10 Embryonen mit extra embryonaler Flüssigkeit in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren, die mit einer Linie bei einem Volumen von 250 Mikrolitern markiert sind. Fügen Sie der Fülllinie Wasser hinzu.
Bereiten Sie zusätzliche Mikrozentrifugenröhrchen für dechorionierte Proben vor. Um die Chorion zu entfernen, inkubieren Sie die Embryonen in einer 100-Millimeter-Petrischale mit zwei Milligramm pro Milliliter Protease-Cocktail in Embryomedien für 10 Minuten. Mischen Sie das Gericht alle paar Minuten, um den Chorion zu brechen.
Sobald alle Embryonen frei von der Chorion sind, entfernen Sie sie aus dem Protease-Cocktail und waschen Sie sie zweimal mit frischen Medien. Dann die Embryonen in eine frische 100-Millimeter-Schale übertragen. Wenn alle Proben zur Volumenmessung bereit sind, verwenden Sie eine P200-Mikropipette mit der kleinsten Spitze, um sorgfältig alle Flüssigkeiten aus der Umgebung der Embryonen zu entfernen.
Wiegen Sie das Wasser mit einer Skala mit einer Skala von weniger als 0,1 Milligramm Genauigkeit, und bestimmen Sie dann das Volumen der 10 Embryonen, indem Sie das Gewicht des entfernten Wassers von 250 Mikrolitern subtrahieren. Um das Volumen eines einzelnen Embryos zu bestimmen, dividieren Sie die Differenz durch 10. Sammeln Sie die Embryonen aus den Paarungstanks und legen Sie sie in eine Standard 100 Millimeter Petrischale und bebrüten die Schale dann bei 28,5 Grad Celsius.
Nach sechs Stunden nach der Befruchtung bis zu 100 Embryonen in eine neue Schale mit Embryomedien und 1% Ethanol oder Medien allein übertragen. Bedecken, aber nicht versiegeln Sie die Petri-Gerichte und legen Sie sie in einem 28,5 Grad Celsius Inkubator für 18 Stunden oder bis sie 24 Stunden nach der Düngung erreichen. Verwenden Sie zwei P200-Mikropipetten, die auf 50 Mikroliter eingestellt sind, und aspirieren Sie die Protease-Cocktail-Lösung in eine und gießen Sie sie in die zweite.
Dann legen Sie schnell 10 Embryonen in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit einer Glaspipette und schließen Sie die Kappe. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle zu prüfenden, kontrollierenden Proben und mit Ethanol behandelten Embryonen. Wenn Sie mit jeweils einer Probe arbeiten, öffnen Sie schnell die Kappe und aspirieren Sie alle verbleibenden Embryomedien mit einer P200-Mikropipette, die auf 200 Mikroliter eingestellt ist.
Schnell aber schonend die 50 Mikroliter Wasser hinzufügen und entfernen, dann die 50 Mikroliter Protease-Cocktail hinzufügen und die Rohrkappe schließen. Lassen Sie die Probe für 10 Minuten bei Raumtemperatur sitzen, dann schnell 450 Mikroliter von fünf Mol-Natriumchlorid hinzufügen und die Rohrkappe schließen. Homogenisieren Sie die Probe durch Wirbeln für 10 Minuten und übertragen Sie zwei Mikroliter Überstand auf eine Gaschromatographie-Durchstechflasche.
Versiegeln Sie die Durchstechflasche mit einer Polytetrafluorethylenkappe. Nach Abschluss der Startmethode 436 aktuelle SPME Ethanol zwei bis fünf Minuten RG-Lauf laden. Meth aus dem Methodenmenü in der Analysesoftware für jedes Beispiel in der Beispielliste.
Füllen Sie die Probenliste ab, beginnend mit der Luft, Wasser und fünf Molar-Natriumchlorid-Protease-Cocktail-Rohlinge. Geben Sie dann die Ethanol-Standards in der Reihenfolge von 0,3125 bis 40 Millimolar ein. Folgen Sie den Standards mit der zweiten Runde der Rohlinge.
Geben Sie alle homogenisierten Embryo-Überstandproben ein, die von der niedrigsten bis zur höchsten vorhergesagten Ethanolkonzentration getestet werden sollen, und beenden Sie sie, indem Sie in eine dritte Runde von Rohlingen eintreten. Fügen Sie die Gaschromatographie-Fläschchen in der Reihenfolge, in der die Proben eingegeben wurden, zum Autosampler hinzu und lassen Sie sie 10 bis 15 Minuten erwärmen. Starten Sie dann die Beispielläufe mit der Software.
Nachdem alle Ausführungen abgeschlossen sind, aktivieren Sie die Shutdown-Methode, indem Sie ein endgültiges Beispiel in der Beispielliste hinzufügen und Standby.meth ausführen. Sichern Sie alle Daten, die während des Beispiellaufs erfasst wurden. Sobald die Herunterfahrmethode abgeschlossen ist, klicken Sie auf Chromatogramm öffnen und öffnen Sie den Ordner mit den Ergebnissen.
Samples werden automatisch in dieses Programm integriert. Stellen Sie in den Ergebnissen sicher, dass die richtigen Spitzen integriert wurden. Sobald alle Proben bestätigt wurden, drucken oder exportieren Sie die Ergebnisse.
Zeichnen Sie die Spitzenhöhe der Ethanolstandards in einem Diagramm und berechnen Sie dann die Neigungs-, y-Abfang- und r-Quadratwerte. Erhalten Sie den Ethanolwert für jede Probe, indem Sie die Spitzenhöhe der Probe vom y-Abfang der Standards subtrahieren und diesen Wert durch die Steigung der Standards dividieren. Um die Ethanolkonzentration in den Embryonen zu berechnen, berechnen Sie den Verdünnungsfaktor für jede Probe und multiplizieren Sie den Ethanolwert der Probe mit diesem Verdünnungsfaktor.
Berechnen Sie schließlich Medienreferenzproben, indem Sie den Ethanolwert der Medien mit einem Verdünnungsfaktor von 10 multiplizieren. Um die embryonalen Ethanolkonzentrationen richtig zu berechnen, wurden die Mengen der Embryonen sowohl in ihrem Chorion als auch in ihrem Chorion gemessen. In dieser Analyse machte der Embryo 56% des Gesamtvolumens innerhalb der Chorion aus.
Basierend auf zuvor veröffentlichten Arbeiten wurden 73,6 % als embryonaler Wassergehalt für alle vorgestellten Analysen verwendet. Daraus resultierte Wasser mit 0,82 Mikrolitern der 1,1 Mikroliter embryonalen Volumens. Vom gesamten Wasservolumen sind 49 % im Embryo und 51 % in der extraembryonalen Flüssigkeit enthalten.
Für die Gaschromatographie-Analyse wurden zwei Gruppen von 15 Proben und die Medien, mit denen sie behandelt wurden, fünfmal pro Gruppe gemessen. Der Ethanolgehalt der Medien war 143,6 Millimolar für Gruppe eins und 133,6 Millimolar für Gruppe zwei. Die Ethanolkonzentrationen der Embryonen betrugen durchschnittlich 63,5 Millimolar bzw. 53,1 Millimolar für die Gruppen eins und zwei.
Für jede Probe wurde ein Verhältnis der embryonalen Ethanolkonzentration zu den Mediaspiegeln von Ethanol berechnet. Gruppe eins hatte 44% der Media-Ethanol-Werte, während Gruppe 40% der Medien-Ethanol-Werte hatte. Unbehandelte Kontrollembryonen wurden mit einer Ethanolkonzentration von null Millimolaren Medien gemessen.
Das Wichtigste, was man beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollte, ist, dass die richtige Verarbeitung der Embryonen für die GC-Analyse entscheidend ist, da Ethanol flüchtig ist und schnell verdampft. Der beste Weg, um diesen Schritt durchzuführen, wird beschrieben, aber es muss geübt werden, um richtige Muskelgedächtnis zu entwickeln. Dieses Verfahren wird dazu beitragen, Ethanol-Behandlungssysteme in Zebrafischen zu standardisieren und zukünftige Arbeiten zu ermöglichen, um die genetischen und zellulären Mechanismen der ethanalen Teratogenität zu sezieren.
