Bu protokol, zebra balığı embriyolarının geliştirilmesinde etanolün farmakokinetiğinin anlaşılmasına yardımcı olduğu ve zebra balığı çalışmalarında etanol maruziyeti rejimlerinin standartlaştırılmasına yardımcı olacağı için önemlidir. Tekniğimizin en büyük avantajı, araştırmacıların embriyonik gelişim sırasında, özellikle kan akımının mevcut olmadığı embriyolarda etanol düzeylerini hızla ve tekrarlamayla ölçmelerine olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, diğer model sistemlerine ve uygun teknik ve ekipman kurulumu nun varsayılmasında diğer çevresel faktörlere kolayca uygulanabilir.
Bu protokolü ilk kez gerçekleştiren bireylerin embriyo işleme sırasında etanol buharlaşmasını önlemek için gerekli hızile mücadele etmesini beklerdim. 250 mikrolitre lik bir hacimde bir çizgi ile işaretlenmiş 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpler içine ekstra embriyonik sıvı ile 10 embriyo transfer ederek başlayın. Dolgu hattına su ekleyin.
Dechorionated numuneler için ek mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Chorion kaldırmak için, 10 dakika boyunca embriyo medyada proteaz kokteyl mililitre başına iki miligram ile 100 milimetre petri çanak embriyolar kuluçka. Yavaşça chorion kırmak için her birkaç dakikada bir çanak girdap.
Bir kez tüm embriyolar chorion ücretsiz, proteaz kokteyl onları kaldırmak ve taze medya ile iki kez yıkayın. Sonra embriyoları 100 milimetrelik yeni bir tabağa aktarın. Tüm numuneler hacim ölçümü için hazır olduğunda, embriyoların etrafındaki tüm sıvıyı dikkatlice çıkarmak için mümkün olan en küçük ucuna sahip bir P200 mikropipet kullanın.
Suyu 0,1 miligramdan daha az hassasiyetle tartın, ardından çıkarılan suyun ağırlığını 250 mikrolitreden çıkararak 10 embriyonun hacmini belirleyin. Tek bir embriyonun hacmini belirlemek için farkı 10'a bölün. Embriyoları miyom tanklarında toplayın ve standart 100 milimetrelik Petri kabına yerleştirin ve sonra kabı 28,5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Döllenmeden altı saat sonra, 100 embriyoya kadar embriyo ve %1'lik etanol veya medya ile yeni bir tabağa transfer edin. Petri kaplarını örtmemek ve 28,5 derecelik bir inkübatöre 18 saat veya döllenme sonrası 24 saat ulaşına kadar yerleştirin. 50 mikrolitreye ayarlanmış iki P200 mikropipeti kullanın ve proteaz kokteyl çözeltisini bir eve, ikincisine de suya aspire edin.
Daha sonra cam pipet kullanarak 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 10 embriyoyu hızlıca yerleştirin ve kapağı kapatın. Tüm örnekler, kontroller ve etanol tedavi embriyolar test edilmesi için bu işlemi tekrarlayın. Bir seferde bir örnekle çalışarak, kapağı hızla açın ve 200 mikrolitreye ayarlanmış bir P200 mikropipeti ile tüm artık embriyo ortamını aspire edin.
Hızlı ama yavaşça ekleyin ve su 50 mikrolitre kaldırmak, sonra proteaz kokteyl 50 mikrolitre ekleyin ve tüp kapağıkapatın. Örnek oda sıcaklığında 10 dakika oturup sonra hızlı bir şekilde beş azı lı sodyum klorür 450 mikrolitre ekleyin ve tüp kapağı kapatın. 10 dakika girdap ve bir gaz kromatografi şişesine supernatant iki mikrolitre aktarArak örnek homojenize.
Şişeyi politetrafloroetilen kapakla kapatın. Başlatma yöntemini tamamladıktan sonra, 436 geçerli SPME etanol 2-5 dakikalık RG çalıştırın yükleyin. örnek listedeki her örnek için analiz yazılımındaki yöntem menüsünden meth.
Hava, su ve beş azı lı sodyum klorür proteaz kokteyl boşlukları ile başlayan örnek listesini doldurun. Daha sonra 0,3125 ile 40 milimolar arasında etanol standartlarına girin. Boşlukların ikinci turuyla standartları uygulayın.
En düşükten en yüksek öngörülen etanol konsantrasyonuna kadar test edilecek tüm homojenize embriyo supernatant örneklerini girin ve üçüncü tur boşluklargirerek bitirin. Numunelerin girildiği sırada gaz kromatografi şişelerini otonumuneye ekleyin ve 10 ila 15 dakika ısınmalarını bekleyin. Sonra yazılımı kullanarak örnek çalışır başlatın.
Tüm çalıştırmalar tamamlandıktan sonra, örnek listesine son bir örnek ekleyerek ve bekleme.meth çalıştırarak kapatma yöntemini etkinleştirin. Örnek çalışma sırasında elde edilen tüm verileri yedekle. Kapatma yöntemi tamamlandıktan sonra, açık kromatogramı tıklatın ve sonuçları ile klasörü açın.
Örnekler otomatik olarak bu programa entegre edilir. Sonuçlarda, doğru zirvelerin tümleşik olduğundan emin olun. Tüm numuneler onaylandıktan sonra sonuçları yazdırın veya dışa aktarın.
Bir grafikte etanol standartlarının en yüksek yüksek liğini çizin, ardından eğimi, y-intercept'i ve r kare değerlerini hesaplayın. Her numune için etanol değerini, numunenin en yüksek yüksek liğini standartların y-kesişme noktasından çıkararak ve bu değeri standartların eğimine bölerek elde edin. Embriyolarda etanol konsantrasyonu hesaplamak için, her örnek için seyreltme faktörü hesaplamak ve bu seyreltme faktörü ile örnek etanol değeri çarp.
Son olarak, ortam etanol değerini 10'luk bir seyreltme faktörüyle çarparak ortam referans örneklerini hesaplayın. Embriyonik etanol konsantrasyonlarını doğru hesaplamak için, embriyoların hacimleri hem korolarında hem de korrionlarından çıkarıldı. Bu analizde, embriyo chorion içindeki toplam hacmin %56'sını oluşturmıştır.
Daha önce yayınlanmış çalışmalara dayanarak, sunulan tüm analizlerde embriyonik su içeriği olarak %73,6'sı kullanılmıştır. Bu, 1,1 mikrolitre embriyonik hacmin 0,82 mikrolitresini içeren su yla sonuçlandı. Toplam su hacminin %49'u embriyoda, %51'i ise ekstraembriyonik sıvıda bulunur.
Gaz kromatografisi analizi nde 15 örnekten oluşan iki grup ve tedavi edildikleri ortam grup başına beş kez ölçüldü. Media etanol düzeyleri grup 1 için 143.6 milimolar ve ikinci grup için 133.6 milimolar idi. Embriyoların etanol konsantrasyonları sırasıyla grup bir ve iki için ortalama 63.5 milimolar ve 53.1 milimolar.
Embriyonik etanol konsantrasyonunun her bir örnek için ortam etanol düzeylerine oranı hesaplandı. Birinci grup medya etanol düzeylerinin %44'üne, grup ise medya etanol düzeylerinin %40'ına sahipti. Tedavi edilmeyen kontrol embriyoları sıfır milimolar media etanol konsantrasyonu ile ölçüldü.
Bu prosedürü çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, etanol uçucu olduğu ve hızlı bir şekilde buharlaşacağı için GC analizi için embriyoların düzgün bir şekilde işlenmesinin kritik öneme sahip olmasıdır. Bu adımı gerçekleştirmek için en iyi yolu açıklanmıştır, ancak uygun kas hafızası geliştirmek için uygulanması gerekir. Bu prosedür zebra balığında etanol tedavi rejimlerinin standartlaştırılmasına yardımcı olacak ve gelecekteki çalışmaların etanal teratojenitenin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemesine olanak sağlayacaktır.
