Este protocolo é significativo porque ajuda na compreensão da farmacocinética do etanol no desenvolvimento de embriões de zebrafish e isso ajudará a padronizar os regimes de exposição ao etanol em estudos de zebrafish. A principal vantagem de nossa técnica é que permite aos pesquisadores medir rapidamente e reprodutivelmente os níveis de etanol durante o desenvolvimento embrionário, particularmente em embriões onde o suprimento de sangue não está disponível. Este método pode ser facilmente aplicado a outros sistemas de modelo, bem como outros fatores ambientais assumindo a técnica adequada e a configuração do equipamento.
Eu esperaria que os indivíduos que executam este protocolo pela primeira vez lutassem com a velocidade necessária para evitar a evaporação do etanol durante o processamento de embriões. Comece transferindo 10 embriões com fluido embrionário extra em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitros marcados com uma linha em um volume de 250 microliters. Adicione água à linha de enchimento.
Prepare tubos adicionais de microcentrifuuge para amostras descorriodas. Para remover o acorde, incubar os embriões em uma placa de Petri de 100 milímetros com dois miligramas por mililitro de coquetel de protease em mídia de embriões por 10 minutos. Gire suavemente o prato a cada poucos minutos para quebrar o acorde.
Uma vez que todos os embriões estejam livres do acorde, remova-os do coquetel protease e lave-os duas vezes com mídia fresca. Em seguida, transfira os embriões para um prato fresco de 100 milímetros. Quando todas as amostras estiverem prontas para medição de volume, use uma micropipette P200 com a menor ponta possível para remover cuidadosamente todo o líquido ao redor dos embriões.
Pesar a água com uma balança com menos de 0,1 miligrama de precisão, em seguida, determinar o volume dos 10 embriões subtraindo o peso da água removida de 250 microliters. Para determinar o volume de um único embrião, divida a diferença em 10. Reúna os embriões dos tanques de acasalamento e coloque-os em uma placa de Petri padrão de 100 milímetros e incubar a placa a 28,5 graus Celsius.
Em seis horas após a fertilização, transfira até 100 embriões para um novo prato com mídia embrionária e 1% de etanol ou mídia sozinho. Cubra, mas não sele as placas de Petri e coloque-as em uma incubadora Celsius de 28,5 graus por 18 horas ou até que atinjam 24 horas após a fertilização. Use dois micropipettos P200 definidos para 50 microliters e aspire a solução de coquetel protease em um e água no segundo.
Em seguida, coloque rapidamente 10 embriões em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro usando uma pipeta de vidro e feche a tampa. Repita este processo para que todas as amostras sejam testadas, controles e embriões tratados com etanol. Trabalhando com uma amostra de cada vez, abra rapidamente a tampa e aspire toda a mídia de embrião residual com uma micropipette P200 definida para 200 microliters.
Adicione rapidamente, mas suavemente, e remova os 50 microliters de água, em seguida, adicione os 50 microliters de coquetel protease e feche a tampa do tubo. Deixe a amostra descansar por 10 minutos à temperatura ambiente e adicione rapidamente 450 microliters de cinco cloreto de sódio molar e feche a tampa do tubo. Homogeneize a amostra por vórtice por 10 minutos e transfira dois microlitadores de supernascer para um frasco de cromatografia gasosa.
Sele o frasco com uma tampa de politetrafluoroetileno. Após completar o método de inicialização, carregue 436 etanol SPME atual de dois a cinco minutos de funcionamento. metanfetamina do menu de métodos no software de análise para cada amostra na lista de amostras.
Preencha a lista de amostras começando com o ar, água e cinco coquetéis de protease de cloreto de sódio molar. Em seguida, entre nas normas do etanol em ordem de 0,3125 a 40 mililitros. Siga os padrões com a segunda rodada de espaços em branco.
Insira todas as amostras de sobrenaspentes de embriões homogeneizados a serem testadas da menor e mais alta concentração de etanol prevista e finalize entrando em uma terceira rodada de espaços em branco. Adicione os frascos de cromatografia gasosa ao autosampler na ordem em que as amostras foram inseridas e permita que elas aqueçam por 10 a 15 minutos. Em seguida, inicie as amostras usando o software.
Depois de todas as execuções serem concluídas, ative o método de desligamento adicionando uma amostra final na lista de amostras e executando standby.meth. Ressardepois de todos os dados adquiridos durante a execução da amostra. Uma vez que o método de desligamento esteja concluído, clique em cromatograma aberto e abra a pasta com os resultados.
As amostras são automaticamente integradas neste programa. Nos resultados, certifique-se de que os picos corretos foram integrados. Uma vez confirmadas todas as amostras, imprima ou exporte os resultados.
Plote a altura máxima dos padrões de etanol em um gráfico, em seguida, calcule os valores de inclinação, y-intercept e r ao quadrado. Obtenha o valor do etanol para cada amostra subtraindo a altura máxima da amostra a partir da interceptação y das normas e dividindo esse valor pela inclinação das normas. Para calcular a concentração de etanol nos embriões, calcule o fator de diluição para cada amostra e multiplique o valor amostral do etanol por este fator de diluição.
Por fim, calcule as amostras de referência de mídia multiplicando o valor do etanol de mídia por um fator de diluição de 10. Para calcular adequadamente as concentrações embrionárias de etanol, os volumes de embriões tanto em seu acorde quanto removidos de seu chorão foram medidos. Nesta análise, o embrião compreendeu 56% do volume total dentro do chorão.
Com base em trabalhos publicados anteriormente, 73,6% foram utilizados como teor de água embrionária para todas as análises apresentadas. Isso resultou em água composta por 0,82 microlitres dos 1,1 microliters de volume embrionário. Do volume total de água, 49% está contido no embrião e 51% no fluido extraembrínico.
Para a análise da cromatografia gasosa, foram analisados dois grupos de 15 amostras e os meios com os quais foram tratados medidos cinco vezes por grupo. Os níveis de etanol de mídia foram de 143,6 milimililar para o grupo um e 133,6 mililitros para o grupo dois. As concentrações de etanol dos embriões tiveram uma média de 63,5 milimililar e 53,1 mililitro para os grupos um e dois, respectivamente.
Calculou-se uma razão de concentração de etanol embrionário para os níveis de mídia de etanol para cada amostra. O grupo um tinha 44% dos níveis de etanol de mídia, enquanto o grupo tinha 40% dos níveis de etanol de mídia. Os embriões de controle não tratados foram medidos na concentração de etanol de mídia zero mililitro.
A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este procedimento é que o processamento dos embriões para análise de GC adequadamente é fundamental, pois o etanol é volátil e evaporará rapidamente. A melhor maneira de realizar esta etapa é descrita, mas precisa ser praticada para desenvolver a memória muscular adequada. Este procedimento ajudará a padronizar os regimes de tratamento do etanol em zebrafish e permitirá que futuros trabalhos dissequem os mecanismos genéticos e celulares da teratogenicidade etanoal.
