גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר חיסון גליקונקונג'גייט הומוגני על ידי שילוב של שילוב חומצות אמינו לא קנוניות וכימיה של קליק. הרחבת קוד גנטי היא כלי רב עוצמה לשלב חומצות אמינו לא טבעיות בחלבונים כדי לשנות את המאפיינים שלהם, ללמוד או ליצור פונקציות חלבון חדשות, או לקבל גישה מצומד חלבון. שיטת דיכוי קודון התפתחה כשיטה הפופולרית ביותר לשלב חומצות אמינו לא טבעיות בעמדות שונות.

מתודולוגיה זו תחול כאן על ייצור נשא חלבון המכיל חומצת אמינו לא טבעית המטפחת קבוצה תפקודית ביו-רוטוגונלית. ידית תגובתי זה יכול לשמש באופן ספציפי וביעילות השתלת אויגוסכריד הפטן סינתטי כדי לספק חיסון glycoconjugate הומוגני. הפרוגרג'יל-לי לסין, PrK, מסונתז בשני צעדים מבוק-לייסין מסחרי.

בשלב הראשון, קבוצת האמינו הלא מוגנת של הבוק-ליזין מומרת לפרופרג'יל כלורופורמט. בשלב השני, קבוצת האמינו אלפא היא דה מוגן. כדי לסנתז את N(אלפא)Boc-propargyl-ליזין, הראשון להמיס 500 מיליגרם של Boc-ליסין בתערובת של חמישה מיליליטר של אחד מימית molar NaOH וחמישה מיליליטר של THF בבקבוק ומתאימים את הבקבוק עם מחיצת סיליקון.

מקררים את הבקבוק באמבט קרח ומחכים להמסת האבקה. לאחר מכן מוסיפים את הפרוגרג'יל כלורופורמט טיפה חכם על פני תקופה של שתיים עד שלוש דקות תחת ערבוב. מחממים את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר וממשיכים את ה ערבוב במשך 10 שעות.

לקרר פתרונות של אתר diethyl, חומצה הידרוכלורית אחת קווירית, ואתיל אצטט. מצננים את תערובת התגובה הגולמית באמבט קרח. יוצקים את התערובת במשפך מפריד.

מוציאים תערובת עם חמישים מיליליטר של אתר דיתיל. החילוץ עלול לגרום הצטברות של לחץ, הקפד לשחרר כל הצטברות לחץ לעתים קרובות. אוספים את השלב הממימי ומשליכים את השכבה האורגנית.

מוסיפים בזהירות, חמישים מיליליטר של חומצה הידרוכלורית אחת לחומצה הממית במשפך המפריד. לאחר מכן, לחלץ את השכבה המים פעמיים באמצעות שלושים מיליליטר של אתיל אצטט. לאסוף את השלב האורגני, לאמת את נוכחותו של המתחם שלך על ידי TLC.

בשלב זה, זה צריך להיות בשלב האורגני. יבש את השכבות האורגניות המשולבות על מגנזיום גופרתי. סנן את השלב המוצק.

ולרכז את הסינון תחת לחץ מופחת על אידוי סיבובי. להמיס מדגם של N(אלפא)Boc-propargyl-ליזין גולמי בכלורופורם deuterated ולשלוט בזהותו על ידי NMR. לסנתז את propargyl-L-ליזין, להציג את N(אלפא)Boc-propargyl-ליזין בבקבוק כפתור עגול מצויד מחיצה.

הוסף ארבעה מיליליטר של דיכלורומטן נטול מים לתוך הבקבוק מתחת לארגון. הוסף טיפה חכם, ארבעה מיליליטר של חומצה trifluoroacetic תחת ערבוב. החלף את מחיצת הסיליקון למכסה זכוכית כדי למנוע מ- TFA לפגוע במ מחיצת הסיליקון.

מערבבים את תערובת התגובה במשך שעה בטמפרטורת החדר. ודא את ביטול ההגנה של ה- Boc-PrK על-ידי TLC. לרכז את תערובת התגובה תחת לחץ מופחת.

תוסיף אתר דיתיל לשאריות הגולמיות. סנן את הפרוגרג'יל-ל-ליסטין בצורה של מוצק לבן על זכוכית קפואה. להמיס aliquot של propargyl-L-ליזין תחמוצת דיטריום, ולאחר מכן לבצע ניתוח NMR כדי לשלוט בזהותו וטוהר.

Propargyl-L-ליצין מומס אז במים מזוקקים בריכוז הסופי של מאה מילימולרים ומאוחסן במינוס 20 מעלות ב aliquots מיליליטר אחד. כדי להפוך פלסמידים במשותף לזן הביטוי, להפשיר מאה microliters aliquot של E.Coli BL21 מוסמך כימית על קרח במהלך חמש דקות. מוסיפים מיקרוליטר אחד של כל פלסמיד או חמישים עד מאה ננוגרם של כל אחד לתוך התאים ו דגירה אותם במשך 30 דקות על קרח.

דגירה התאים המוסמכים ב 42 מעלות, במהלך 45 שניות. ואז, לשים אותם בחזרה על קרח במשך שתי דקות. מוסיפים 900 מיקרוליטרים של LB בינוני דגירה תחת רועד במשך שעה אחת ב 37 מעלות כדי לאפשר ביטוי אנטיביוטיקה.

ואז צלחת חיידקים שהשתנו על אגר LB עם אנטיביוטיקה. אפשר לחיידקים לגדול בן לילה ב-37 מעלות. כדי לבטא חלבונים ששונו עם PrK, יש לחסן מושבה אחת שהשתנתה במשותף בחמישה מיליליטר של מדיום LB עם אנטיביוטיקה.

דגירה לילה ב 37 מעלות עם רעידות. למחרת, לדלל עם חמשת המיליליטרים של התרבות העיקרית בחמש מאות מיליליטר של מדיום אינדוקציה אוטומטי המכיל אנטיביוטיקה, 0.02% של L-arabinose, ומילימולר אחד של PrK ודגירה ב 37 מעלות במשך 24 שעות תחת רעידות. כלול שליטה שלילית על-ידי ביצוע התרבות ללא PrK והשליטה החיובית על-ידי ביצוע התרבות של שיבוט המכיל את גן החלבון מסוג הבר.

קציר תאים מתרבות הלילה על ידי צנטריפוגה ב 5, 000 x גרם במהלך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי והקפיאו את גלולת המינוס 20 מעלות. לטיהור החלבון על ידי כרומטוגרפיה של זיקה לספסל הזרימה של כוח הכבידה, יש למגר את כדורי התא לעשרים מיליליטר של מאגר תיזה.

מוסיפים DNase I ו lysozyme, ולאפשר תזה על ידי דגירה ההשעיה ב 37 מעלות במהלך 30 דקות. Sonicate התאים בקרח במהלך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 x g במהלך 30 דקות. סינון lysate עם מסנן מיקרומטר 0.45 הוסף שרף Ni-NTA להשעיה.

מערבבים בעדינות בארבע מעלות במשך שעה. יוצקים את ההשעיה לתוך עמוד פוליפרופילן ולאסוף את השבר מאוגד. לשטוף את שהף עם עשרה מיליליטר ולאחר מכן חמישה מיליליטר של חיץ כביסה.

לאסוף את שברי לשטוף. אלוט חלבון מתויג שלו עם מילימטר אחד של חיץ אלוטיון ולחזור על שלב זה ארבע פעמים ולאסוף את כל השברים הנוספים. ערבבו את השברים המכילים חלבונים מתויגים בהיסטידין טהור והתוגנו אותו לליטר אחד של חיץ פרוטאז TEV בן לילה באמצעות קרום דיאליזה.

לאסוף את דגימת החלבון לתוך צינור 50 מיליליטר ולהוסיף חיץ TEV כדי לקבל ריכוז סופי של שני מיליגרם למיליליטר בנפח סופי של מיליליטר אחד. הוסף מאה מיקרוליטרים של פרוטאז TEV. הוסף 50 מיקרוליטרים של DTT טוחן 0.1.

להשלים עם חיץ TEV עד חמישה מיליליטר. דגירה לילה בארבע מעלות, עם רעידות איטיות. כדי להסיר EDTA, דיאליזה החלבון בארבע מעלות לילה באמצעות קרום דיאליזה חיץ פוספט עם חמישה מילימולרים imidazole.

כדי לחסל פרוטאז TEV וחלבונים לא מעוכלים, הדגירה את התערובת עם חטיף Ni-NTA ומערבבים בעדינות במשך שעה אחת בארבע מעלות. יוצקים את ההשעיה לתוך עמוד פוליפרופילן. אסף את השבר הלא מאוגד.

פרוטאז TEV וחלבונים מעוכלים נשארים קשורים לחרוזים והחלבון המתעכל הוא אלוט. לשטוף את העמוד עם חמישה מיליליטר של חיץ כביסה ולאסוף את שברי לשטוף גם כן. דיאליזה החלבון מתעכל נגד ליטר אחד של חיץ לחץ בארבע מעלות לילה עם קרום דיאליזה כדי להסיר imidazole, כמו גם להחליף את החיץ.

ולמדוד את ריכוז החלבון ב 280 ננומטר. כדי להצטייד mPsaA עם 6-hexachloro-פלואורסצין-אזיד, או אנטיגן פחמימות פונקציונלי נוגדן, לשים את החלבון מוטציה PrK בריכוז של 57.8 micromolar לתוך צינור מיקרו שני מיליליטר. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של תרכובת אזיד מילימולרית, ולאחר מכן מוסיפים תערובת מוקדמת של תותבת נחושת גופרתית ו- THPTA.

מוסיפים אמינוגואנידין הידרוכלוריד. הוסף פתרון מים שהוכן באופן מאולתר של אסקורבאט נתרן. סוגרים את הצינור, מערבבים על ידי היפוך מספר פעמים ודגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.

הפסק את התגובה על-ידי הוספת EDTA. בדוק את ההתרברבות בדף SDS. לאחר הנדידה, לדמיין את הג'ל על אור UV ב 312 ננומטר עבור משותף עם פלואורסאצין.

או להכתים את הג'ל עם כחול קומאסי כדי לדמיין את הצ'ינס עם אנטיגן פחמימות. כמו תוספת של hapten צריך לגרום לשינוי של משקל מולקולרי. לטהר את glycoconjugate על ידי החלת אותו על עמודת סינון ג'ל שיווי משקל עם PBS.

לאסוף את השברים המכילים את glycoconjugates. לאחסון ממושך, יש להצטייד בגליקונקונג'גייט כנגד המים המזוקקים, ואז להקפיא-יבש ולאחסן את הגליקונקונג'גייט במינוס 80 מעלות. PrK כבר הציג בעמדה 32 בהחלפת ליסינוס ליד N-terminus של PsaA.

היעילות של ייצור mPsaA נבדקה על ידי דף SDS וניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדן תג אנטי היסטידין. נוכחותו של חלבון באורך מלא מצביעה בחוזקה על שילוב מוצלח של PrK. האינטנסיביות היא, עם זאת, נמוכה יותר מזה שנצפה עבור mPsaA מסוג פראי.

MPsaA(K32PrK)כבר מטוהרים על חנוזי Ni-NTA. עם תשואה אופיינית של שמונה מיליגרם ואת שילוב של שאריות PrK אושרה לבסוף על ידי ספקטרומטריית מסה. תג היסטידין הוסר על מחשוף פרוטאוליטי באמצעות פרוטאז TEV.

לאחר mPsaA(K32PrK)תגובתיות של אלקין הוערך באמצעות פלואורסין פונקציונלי אזידו ו משמש עוד יותר כדי להצטייד אנטיגן אוליגוסכריד סינתטי. ניסויים נעשו בהשוואה ל- MPsaA מסוג פראי כפקד. לבסוף, הגליקונקונג'גייט טוהר על ידי סינון ג'ל וזהותו אושרה על ידי ספקטרומטריית מסה.

בפרויקט זה, חיסונים הומוגניים glycoconjugate הוכנו באמצעות טכנולוגיית דיכוי קודון עצירת ענבר לשלב חומצת אמינו לא טבעית תחת אתרים מוגדרים. הומוגניות חיסון Glycoconjugate הוא קריטריון חשוב כדי להבטיח אפיון פיזיקו-כימי מלא. ובכך, מספק יותר ויותר המלצות סוכנות סמים תובעניות.

קריטריון זה אינו מסופק על ידי שימוש בשיטת ההתייחדות הטהורה הקלאסית. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לכוונן היטב את מבנה החיסון glycoconjugate. מעורר כלי חסר תקדים ללמוד את הקשר בין ההומוגניות לבין המבנה של גליקונקוג'גייט.