עם TRAP, אנו יכולים לחקור עיבוד התפתחותי ברזולוציה סלולרית. אנו משתמשים ביזמים ספציפיים לתאים כדי לנהוג בתת-יחידה ריבוזומלית מתויגת, משם אנו יכולים לבודד RNA פוליזום. פרוטוקול זה מניב RNA באיכות גבוהה, אך בכמויות מוגבלות מאוד, לכן, שיטות המתמחות בקלט אולטרה נמוך נדרשות כדי לייצר באופן אמין ספריות RNA באיכות גבוהה.
TRAP הוא כלי אידיאלי לחקר הצמח, כי תהליכים התפתחותיים רבים מסתמכים על מסלולי איתות הקשורים לקיר התא ומכאני. אנו משתמשים ב- TRAP כדי לחקור תקשורת תאים-תאים במבנה שורשים בין-תאיים. כמו קבלת RNA באיכות טובה הוכיח לא ישר קדימה כפי שציפינו, אנו מקווים כי הוראת וידאו צעד אחר צעד זה יגדיל את ישימות TRAP ולעזור לקדם טכניקה רבת עוצמה זו.
כדי לעקר את הקווים הומוזיגיים מופצים, להפיץ פחות מ 300 microliters של זרעים באופן שווה על 12 על ידי 12 ס"מ בריבוע צלחות פטרי, לערום את הכלים על 60 ליטר desiccator. לאחר עיקור גז לילה, תן לגז להתאדות לפני איסוף הזרעים לתוך צינור אחסון 50 מיליליטר. לפני ציפוי, לדלל את הזרעים מעוקרים עם 0.1% אגר כדי לקבל מיליליטר אחד של תערובת זרעים חד-סיבית לכל צלחת.
כדי לרכך את תערובת הזרעים, השתמשו במכסי צלחת פטרי מרובעים ליצירת מחזיק תבנית למין לשתילת שלוש שורות זרעים לצלחת, והכנסו צלחות אגר ריקות למחזיק התבנית. מפיצים מיליליטר אחד של הזרעים המוטבעים באופן שווה על שלוש שורות של צלחות. ומ מניחים את הצלחות המעובדות בערימות בזרימה למינארית, עד שהזרעים יבשים.
כאשר זרעים נדבקו לפני השטח של אגר, לסגור את המכסים ולאטום כל צלחת עם סרט מיקרופור. לטיפול אקסוגני בשורשי Arabidopsis עם סוכן של עניין, להכין 1.5 עד שני סנטימטר רחב, 10 סנטימטר ארוך, רצועות של נייר טישו. משרים את נייר הרקמה ב-10 מיקרומולרים NAA, ולהשתמש פינצטה כדי להחיל רצועה של נייר טישו על כל שורה של שורשים.
לאחר מכן, בעדינות ללחוץ את כל בועות האוויר, ולרוקן את הנוזל העודף מהצלחת, לפני תיוג הצלחת עם הזמן. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השתמש במקלפים כדי להסיר בזהירות את רצועות נייר הרקמה מכל צלחת מבלי לנתק את השורשים, ולהשתמש בלהב כירורגי כדי לחתוך פעם אחת בכל שורה לאורך צומת שורש הירי, בשבץ נחוש אחד. השתמש פינצטה כדי להחליק לאורך השורשים של כל שורה, כדי לאסוף את השורשים בשלוש חבילות.
ולרוקן את השורשים לתוך צינור 50 מיליליטר מלא חנקן נוזלי, להקפאת הצמד. כאשר כל דגימות השורש לכל טיפול נאספו, decant חנקן נוזלי עודף באמצעות מכסה הצינור כדי למנוע את השורשים לשפוך. ומ מניחים את הצינור לתוך כלי עושה, לאחסון 80 מעלות צלזיוס.
לטחינת רקמות ולהומוגניזציה, לבשו כפפות כותנה תחת כפפות מעבדה סטנדרטיות, והוסיפו PMSF למאגר מיצוי הפוליסום. רוקנו את דגימת הרקמה לתוך מרגמה המכילה חנקן נוזלי, ולהשתמש עלה מקורר לטחון בזהירות את הרקמות עד שכל החומר מופיע כמו אבקה לבנה. כאשר כל הרקמה כבר הקרקע, להוסיף חמישה מיליליטר של מאגר מיצוי פולאזום לדגימה, במהירות לערבב את שברי רקמה קפואה עם האבקה לפני המאגר קופא.
ברגע שניתן להעביר את התערובת, רוקנו את התרסיס לתוך הומוגניזר זכוכית על קרח, ולהשתמש בשני מיליליטר נוספים של חיץ מיצוי פוליוזום כדי לשטוף את המרגמה ואת העלי. לטחון ידנית את תרחיף עד התמצית היא הומוגנית. לאחר מכן, יוצקים את תמצית השורש הגולמי לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על קרח, ולעבד את המדגם הבא כפי שהוכח.
עבור איסוף RNA כולל, העבר 200 אליקוטים מיקרוליטר של כל מדגם גולמי לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים נקיים, מקוררים מראש ומסומנו. כדי להסיר קירות תאים, פסולת, ואברונים גדולים, צנטריפוגה הדגימות ו decant את supernatant לתוך צינורות חרוט טריים, מקורר מראש עבור צנטריפוגה שנייה. בעוד הצינורות מסתובבים, aliquot 60 microliters של חרוזי GFP מגנטיים לכל מדגם, לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
ולמקום את הצינור על מעמד מגנטי, כדי להקל על הסרה על טבעית. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעמיים במיליליטר אחד של חיץ לשטוף קר לכל לשטוף, ולהשעות מחדש את חרוזים 60 microliters של חיץ לשטוף לכל מדגם. מיד לאחר הצנטריפוגה, decant supernatant פינה לתוך שכותרתו צינורות 15 מיליליטר, ולהוסיף 60 microliters של חרוזים שטף לכל מדגם.
לאחר מכן, מניחים את כל הדגימות אופקית לתוך דלי קרח, עבור דגירה של שעתיים עם נדנדה. בסוף הדגירה, לאסוף את חרוזים על מעמד מגנטי על קרח, ולהוסיף PMSF למאגר מיצוי פולים הנותרים. לאחר השלכת supernatants, להוסיף כחמישה מיליליטר של מאגר מיצוי פוליאזום לדגימות, ולהשעות מחדש את חרוזים בתוך הדגימות עם הטיה עדינה.
רוק הדגימות במשך 15 דקות על שייקר על קרח, ואחריו שתי שטיפות עם חיץ לשטוף טרי על המגנט, כפי שהודגם. לאחר הכביסה האחרונה, להעביר את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ לשטוף, לתוך צינור 1.5 מיליליטר. ולאסוף את חרוזים עוד פעם אחת על הדוכן המגנטי, כדי להסיר את כל העל טבעי.
לאחר מכן, מניחים את הצינורות על קרח עד שכל הדגימות עובדו. לתיאום אספקת המעבדה, ראשית, שטפו את כל הציוד לפסולת הכימית. לשטוף את הידיים את המרגמות, העלים וההומוגניזרים בסבון, לפני שטיפת כל מכשיר ביסודיות.
לאחר מכן, מניחים את הציוד במיכל בטוח לחום, ואופים את החומרים לילה מעל 220 מעלות צלזיוס. מברישים את כל צינורות הצנטריפוגה נקיים עם חומר ניקוי, לפני הנחת הצינורות על מגש autoclaveable עם שפה מכסה המנוע אדים. יוצקים מיליליטר אחד של דיתיל פירוקרבונט נוזלי וליטר אחד של תותבת מים deionized על הצינורות במשך שלוש עד 18 שעות.
לאחר מכן, לאסוף את הפתרון לפני עיקור מגש של צינורות autoclave. כאן, מוצגים צמחים מייצגים עם אותות GFP. כתם נגדי עם יודיד פרופיד מסמן את קווי המתאר של קיר התא.
הקווים תואמים לתבנית לוקליזציה של האנדידרמיס, ולקרסיקל הקוטב הקסים. במדידות מייצגות אלה שהתקבלו מ- RNA פוליזיום, רוב הדגימות הראו השפלה מועטה מאוד, עם מספרי שלמות RNA הנעים בין תשעה ל -10. בגרפים אלה, ניתן לראות עקבות של ספריות שהוכנו בהצלחה, המדגישות את החוסן של ההליך, למרות נפחי תגובה מוקלדים.
לפני הפקת ערכת נתונים פורשת גנום, TRAP RNA מניסוי פיילוט ניתן לחקור על ידי RTPCR כמותי כדי לאמת את הצלחת הטיפול ו / או את התנאים הניסיוניים, כמו גם את הספציפיות של הרקמה. בניתוח זה, הבדיקה של שלושה גנים מגיבים לאוקסין אישרה אינדוקציה הורמונלית מוצלחת לאחר שעתיים של טיפול. פרופילי גנים ספציפיים לרקמות שאוחזרו מנתוני רצף אישרו את הספציפיות של סוג התא.
בצע ייעוץ תרגול טוב כאשר אתה מטפל RNA. לעבוד על ספסל סטרילי, לנקות את הציוד שלך עם פתרון להסרת RNA, ללבוש כפפות מיד לשנות אותם כאשר הם מקבלים מזוהמים. הקפד לטפל כראוי להשליך את כל הכימיקלים והגזים הרעילים ששימשו במהלך ההליך, במיוחד גז כלור פנול-DEPC וחנקן נוזלי.
בפורטפוליו של מחקרים אומיים, TRAP תופסת נישה חשובה, וכבר שימשה כדי לענות על שאלות ביולוגיות רבות, במיוחד בביולוגיה התפתחותית, TRAP יש פוטנציאל עצום.
