С помощью TRAP мы можем исследовать процесс развития в клеточном разрешении. Мы используем клеточный тип-специфических промоутеров для привода помечены рибосомные под-единицы, и оттуда мы можем изолировать полисомной РНК. Этот протокол дает высококачественную РНК, но в очень ограниченных количествах, поэтому методы, которые специализируются на сверхнизком вводе, необходимы для надежного производства высококачественных РНК-библиотек.
TRAP является идеальным инструментом для исследования растений, потому что многие процессы развития опираются на клеточные стенки, связанные и механические сигнальные пути. Мы используем TRAP для изучения клеточной связи в боковом формировании корней. Поскольку получение РНК хорошего качества оказалось не таким прямым, как мы ожидали, мы надеемся, что эта пошаговая видео-инструкция увеличит применимость TRAP и поможет продвинуть этот мощный метод.
Чтобы стерилизовать размножаемые гомозиготные линии, равномерно распределив менее 300 микролитров семян на 12 на 12 сантиметров в квадрате чашек Петри, и сложите посуду на 60-литровый децикатор. После ночной стерилизации газа, пусть газ испаряется перед сбором семян в 50 миллилитров трубки хранения. Перед покрытием разбавить стерилизованные семена 0,1%агара, чтобы получить один миллилитр впитываемой смеси семян на тарелку.
Чтобы посадить смесь семян, используйте квадратные крышки чашки Петри, чтобы создать ламинированный держатель шаблона для посадки трех рядов семян на тарелку, и поместите пустые пластины агара в держатель шаблона. Равномерно распределим один миллилитр впитываемых семян на три ряда пластин. И поместите обработанные пластины в штабеля в ламинарный поток, пока семена не высохнут.
Когда семена прилипли к поверхности агара, закройте крышки и запечатать каждую пластину с помощью микропорной ленты. Для экзогенного лечения корней арабидопсиса с агентом интереса, подготовить от 1,5 до двух сантиметров в ширину, 10 сантиметров длиной, полоски бумаги. Замочите бумагу в 10 микромоляных NAA, и использовать пинцет, чтобы применить полоску бумаги для каждого ряда корней.
Затем осторожно нажмите любые пузырьки воздуха, и опорожнить избыток жидкости из пластины, прежде чем маркировки пластины со временем. В соответствующей экспериментальной точке конца, используйте типсы, чтобы тщательно удалить полоски бумаги ткани с каждой пластины, не отделяя корни, и использовать хирургическое лезвие, чтобы сократить один раз в ряд вдоль стрелять корень соединения, в один решительный удар. Используйте пинцет, чтобы проведите по корням каждого ряда, чтобы собрать корни в три пучка.
И опорожните корни в 50 миллилитровую трубку, наполненную жидким азотом, для замораживания оснастки. Когда все образцы корня для обработки были собраны, decant сверхнормативный жидкий азот используя крышку пробки для того чтобы предотвратить корни от разливать. И поместите трубку в сосуд, для хранения 80 градусов по Цельсию.
Для измельчения тканей и гомогенизации носите хлопчатобумажные перчатки под стандартными лабораторными перчатками и добавляйте PMSF в буфер полисомной экстракции. Опустите образец ткани в ступку, содержащую жидкий азот, и используйте охлажденный пестик, чтобы тщательно измельчить ткани, пока весь материал не появится в виде белого порошка. Когда вся ткань будет заземлена, добавьте в образец пять миллилитров буфера полисомной экстракции и быстро смешайте замороженные фрагменты тканей с порошком до того, как буфер замерзнет.
Как только смесь может быть передана, опорожните суспензию в стеклянный гомогенизатор на льду, и использовать дополнительные два миллилитров полисомы буфера экстракции для полоскания раствора и пестика. Вручную измельчите суспензию до тех пор, пока экстракт не станет однородным. Затем, залить сырой экстракт корня в 50 миллилитров центрифуги трубки на льду, и обработать следующий образец, как попродемонстрировано.
Для общего сбора РНК перенесите 200 микролитров алицитов каждого сырого образца в отдельные чистые, предварительно охлажденные, помеченные микроцентрифуговые трубки. Чтобы удалить клеточные стенки, мусор и большие органеллы, центрифуга образцов и декантировать супернатант в свежие, предварительно охлажденные конические трубки для второй центрифугации. В то время как трубки вращаются, aliquot 60 микролитров магнитных бусин GFP на образец, в 1,5 миллилитровую трубку.
И поместите трубку на магнитную подсвечку, чтобы облегчить удаление супернатанта. Затем, мыть бисер два раза в один миллилитр холодного буфера мытья на стирку, и повторно приостановить бисер в 60 микролитров мыть буфера на образец. Сразу же после центрифугации, декант очищенного супернатанта в помечены 15 миллилитров труб, и добавить 60 микролитров промытых бусин в каждом образце.
Затем поместите все образцы горизонтально в ведро со льдом, в течение двух часов инкубации с качанием. В конце инкубации соберите бисер на магнитной подгофе на льду и добавьте PMSF в оставшийся буфер извлечения полисомы. После отбрасывания супернатантов добавьте в образцы около пяти миллилитров буфера извлечения полисомы и повторно приостановите бисер в образцах с нежным наклоном.
Рок образцов в течение 15 минут на шейкер на льду, а затем два моет со свежим буфером мытья на магните, как попродемонстрировано. После последней стирки перенесите образцы в один миллилитр буфера для мытья в 1,5 миллилитровую трубку. И собрать бисер еще раз на магнитной поднося, чтобы удалить все супернатанты.
Затем поместите трубки на лед до тех пор, пока все образцы не будут обработаны. Для восстановления лабораторных принадлежностей, во-первых, промыть все оборудование в химические отходы. Ручная мытья растворов, пестиков и гомогенизаторов с мылом, прежде чем промыть каждый инструмент тщательно.
Затем поместите оборудование в теплобезопасный контейнер и выпекайте материалы на ночь при температуре более 220 градусов по Цельсию. Кисть все центрифуги трубки очистить с моющим средством, прежде чем поместить трубки на автоклавный лоток с ободом и дым капот. Налейте один миллилитр жидкого дитил пирокарбоната и один литр деионизированного раствора воды на трубы в течение трех-18 часов.
Затем соберите раствор перед стерилизацией лотка трубок в автоклаве. Здесь показаны представительные установки с сигналами GFP. Контр-окрашивание с propidium йодид отмечает очертания клеточной стенки.
Линии соответствуют шаблону локализации эндодермиса и ксилем-полюсного перицикла. В этих репрезентативных измерениях, полученных с помощью полисомной РНК, большинство образцов показали очень небольшую деградацию, при этом показатели целостности РНК варьируются от девяти до 10. На этих графиках можно наблюдать следы успешно подготовленных библиотек, подчеркивая надежность процедуры, несмотря на уменьшенные объемы реакции.
Перед производством набора данных, охватывающего геном, РНК TRAP из экспериментального эксперимента может быть исследована количественным RTPCR для проверки успеха лечения и/или экспериментальных условий, а также специфичности тканей. В этом анализе, тестирование трех auxin-ответных генов подтвердило успешную индукцию гормона после двух часов лечения. Профили генов маркеров, полученные из данных секвенирования, подтвердили специфичность клеточного типа.
Следуйте рекомендациям хорошей практики, когда вы справляетесь с РНК. Работайте на стерильной скамейке, очищайте оборудование раствором для удаления РНК, носите перчатки и немедленно меняйте их, когда они загрязняются. Будьте уверены, чтобы надлежащим образом обрабатывать и отказаться от всех токсичных химических веществ и газов, которые были использованы во время процедуры, особенно фенол-DEPC хлора газа и жидкого азота.
В портфолио омических исследований TRAP занимает важную нишу и уже используется для ответа на многие биологические вопросы, особенно в биологии развития, TRAP имеет огромный потенциал.
