Mit TRAP können wir die Entwicklungsverarbeitung bei zellulärer Auflösung untersuchen. Wir verwenden zelltypspezifische Promotoren, um eine markierte ribosomale Subeinheit zu fahren, und von dort aus können wir Polysomen-RNA isolieren. Dieses Protokoll liefert qualitativ hochwertige RNA, aber in sehr begrenzten Mengen sind daher Methoden erforderlich, die auf ultra-niedrige Eingaben spezialisiert sind, um zuverlässig hochwertige RNA-Bibliotheken zu produzieren.
TRAP ist ein ideales Werkzeug für die Pflanzenforschung, da viele Entwicklungsprozesse auf zellwandbezogenen und mechanischen Signalwegen beruhen. Wir verwenden TRAP, um die Zell-Zell-Kommunikation bei der lateralen Wurzelbildung zu untersuchen. Da sich die Erlangung von RNA-Qualität nicht so geradlinig wie erwartet erwies, hoffen wir, dass diese Schritt-für-Schritt-Videoanleitung die TRAP-Anwendbarkeit erhöhen und dazu beitragen wird, diese leistungsstarke Technik zu fördern.
Um die vermehrten homozygoten Linien zu sterilisieren, verteilen Sie weniger als 300 Mikroliter Samen gleichmäßig auf 12 mal 12 Zentimeter quadratische Petrischalen und stapeln Sie die Gerichte auf einem 60-Liter-Austrocknungsrezept. Nach der nächtlichen Gassterilisation das Gas verdampfen lassen, bevor es die Samen in ein 50-Milliliter-Speicherrohr sammelt. Verdünnen Sie vor der Beschichtung die sterilisierten Samen mit 0,1% Agar, um pro Platte einen Milliliter imprägnierter Samenmischung zu erhalten.
Um die Samenmischung zu verpflanzen, verwenden Sie quadratische Petrischalendeckel, um einen laminierten Schablonenhalter für die Pflanzung von drei Reihen von Samen pro Platte zu erstellen, und legen Sie leere Agarplatten in den Schablonenhalter. Verteilen Sie einen Milliliter der imbibed Samen gleichmäßig auf drei Reihen von Tellern. Und legen Sie die verarbeiteten Platten in Stapel in einem laminaren Fluss, bis die Samen trocken sind.
Wenn Die Samen an der Oberfläche des Agars kleben, schließen Sie die Deckel und versiegeln Sie jede Platte mit Mikroporenband. Für die exogene Behandlung von Arabidopsis-Wurzeln mit einem Voninteresseer Wirkstoff 1,5 bis zwei Zentimeter breit, 10 Zentimeter lang, Streifen von Tissuepapier vorbereiten. Das Tissuepapier in 10 mikromolare NAA einweichen und eine Pinzette verwenden, um einen Streifen Tissuepapier auf jede Wurzelreihe aufzutragen.
Drücken Sie dann vorsichtig alle Luftblasen heraus und entleeren Sie die überschüssige Flüssigkeit von der Platte, bevor Sie die Platte mit der Zeit beschriften. Verwenden Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt die Tissue-Papierstreifen sorgfältig von jeder Platte, ohne die Wurzeln zu lösen, und verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um einmal pro Reihe entlang der Triebwurzel-Kreuzung in einem einzigen bestimmten Strich zu schneiden. Verwenden Sie eine Pinzette, um entlang der Wurzeln jeder Zeile zu wischen, um die Wurzeln in drei Bündeln zu sammeln.
Und leeren Sie die Wurzeln in einem 50 Milliliter Rohr mit flüssigem Stickstoff gefüllt, für Snap Freezing. Wenn alle Wurzelproben pro Behandlung gesammelt wurden, dekantieren Sie den überschüssigen flüssigen Stickstoff mit dem Rohrdeckel, um zu verhindern, dass die Wurzeln versickern. Und legen Sie die Röhre in ein Doer-Gefäß, für eine 80 Grad Celsius Lagerung.
Zum Gewebeschleifen und Homogenisieren Baumwollhandschuhe unter Standard-Laborhandschuhen tragen und PMSF in den Polysomenextraktionspuffer aufnehmen. Leeren Sie die Gewebeprobe in einen Mörtel, der flüssigen Stickstoff enthält, und verwenden Sie einen gekühlten Stößel, um das Gewebe sorgfältig zu mahlen, bis das gesamte Material als weißes Pulver erscheint. Wenn das gesamte Gewebe geschliffen ist, fügen Sie der Probe fünf Milliliter Polysomenextraktionspuffer hinzu und mischen Sie die gefrorenen Gewebefragmente schnell mit dem Pulver, bevor der Puffer gefriert.
Sobald die Mischung übertragen werden kann, entleeren Sie die Gülle in einen Glashomogenisator auf Eis und verwenden Sie weitere zwei Milliliter Polysomenextraktionspuffer, um mörtel und stößezuspülen. Die Gülle manuell mahlen, bis der Extrakt homogen ist. Dann gießen Sie den Rohwurzelextrakt in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr auf Eis und verarbeiten Sie die nächste Probe wie gezeigt.
Für die gesamte RNA-Sammlung 200 Mikroliter-Aliquots jeder Rohprobe in einzelne saubere, vorgekühlte, markierte Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Um Zellwände, Schutt und große Organellen zu entfernen, zentrieren Sie die Proben und dekantieren Sie den Überstand in frische, vorgekühlte konische Röhren für eine zweite Zentrifugation. Während sich die Röhren drehen, werden 60 Mikroliter magnetischer GFP-Perlen pro Probe in ein 1,5-Milliliter-Rohr einfließen.
Und stellen Sie das Rohr auf einen magnetischen Ständer, um die Überstandentfernung zu erleichtern. Dann waschen Sie die Perlen zweimal in einem Milliliter Kaltwaschpuffer pro Wäsche, und hängen Sie die Perlen in 60 Mikroliter Waschpuffer pro Probe wieder auf. Unmittelbar nach der Zentrifugation den gereinigten Überstand in beschriftete 15-Milliliter-Rohre dekantieren und 60 Mikroliter gewaschene Perlen zu jeder Probe hinzufügen.
Legen Sie dann alle Proben horizontal in einen Eiskübel, für eine zweistündige Inkubation mit Schaukeln. Am Ende der Inkubation die Perlen auf einem magnetischen Ständer auf Eis sammeln und PMSF zum verbleibenden Polysomenextraktionspuffer hinzufügen. Nach dem Wegwerfen der Überräube, fügen Sie den Proben etwa fünf Milliliter Polysomenextraktionspuffer hinzu und setzen Sie die Perlen innerhalb der Proben mit sanftem Kippen wieder auf.
Die Proben 15 Minuten lang auf dem Shaker auf Eis schaukeln, gefolgt von zwei Wäschen mit frischem Waschpuffer auf dem Magneten, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche die Proben in einem Milliliter Waschpuffer in ein 1,5-Milliliter-Rohr geben. Und sammeln Sie die Perlen noch einmal auf dem magnetischen Ständer, um alle Überstand zu entfernen.
Legen Sie dann die Rohre auf Eis, bis alle Proben verarbeitet sind. Für die Instandsetzung der Labormaterialien, zuerst spülen Sie alle Geräte in den chemischen Abfall. Die Mörser, Stößel und Homogenisatoren mit Seife von Hand waschen, bevor sie jedes Instrument gründlich spülen.
Als nächstes legen Sie die Ausrüstung in einen hitzebeheizten Behälter und backen die Materialien über Nacht bei mehr als 220 Grad Celsius. Bürsten Sie alle Zentrifugenrohre mit Reinigungsmittel reinigen, bevor Sie die Rohre auf eine autoklavierbare Schale mit einer Felge und einer Dunstabzugshaube legen. Gießen Sie drei bis 18 Stunden lang einen Milliliter flüssiges Diethylpyrocarbonat und einen Liter deionisierte Wasserlösung auf die Rohre.
Dann sammeln Sie die Lösung, bevor Sie die Schale der Rohre im Autoklaven sterilisieren. Hier werden repräsentative Anlagen mit GFP-Signalen gezeigt. Die Gegenfärbung mit Propidiumjodid markiert die Zellwandumrisse.
Die Linien entsprechen dem Lokalisationsmuster der Endodermis und dem Xylem-Pol-Pericycle. Bei diesen repräsentativen Messungen aus Polysomen-RNA zeigten die meisten Proben einen sehr geringen Abbau, wobei die RNA-Integritätszahlen zwischen neun und zehn reichten. In diesen Graphen können Spuren erfolgreich vorbereiteter Bibliotheken beobachtet werden, die die Robustheit des Verfahrens trotz verkleinerter Reaktionsvolumina hervorheben.
Bevor ein genomübergreifender Datensatz erstellt wird, kann TRAP-RNA aus einem Pilotexperiment mit quantitativem RTPCR untersucht werden, um den Behandlungserfolg und/oder die experimentellen Bedingungen sowie die Gewebespezifität zu validieren. In dieser Analyse bestätigte der Test von drei auxin-responsiven Genen eine erfolgreiche Hormoninduktion nach zwei Stunden Behandlung. Gewebespezifische Marker-Genprofile, die aus den Sequenzierungsdaten abgerufen wurden, bestätigten die Zelltypspezifität.
Befolgen Sie die Ratschläge guter Praxis, wenn Sie mit RNA umgehen. Arbeiten Sie an einer sterilen Bank, reinigen Sie Ihre Geräte mit RNA-Entfernungslösung, tragen Sie Handschuhe und wechseln Sie sie sofort, wenn sie kontaminiert werden. Achten Sie darauf, alle giftigen Chemikalien und Gase, die während des Verfahrens verwendet wurden, angemessen zu behandeln und zu entsorgen, insbesondere Phenol-DEPC-Chlorgas und flüssiger Stickstoff.
Im Portfolio der omic-Studien nimmt TRAP eine wichtige Nische ein und wurde bereits zur Beantwortung vieler biologischer Fragen, insbesondere in der Entwicklungsbiologie, eingesetzt, TRAP hat ein enormes Potenzial.
