TRAP ile, hücresel çözünürlükte gelişimsel işlemeyi araştırabiliriz. Etiketli bir ribozomal alt üniteyi kullanmak için hücre tipine özel organizatörler kullanıyoruz ve oradan polizom RNA'yı izole edebiliriz. Bu protokol yüksek kaliteli RNA verir, ancak çok sınırlı miktarlarda, bu nedenle, ultra-düşük giriş için uzmanlaşmış yöntemler güvenilir yüksek kaliteli RNA kütüphaneleri üretmek için gereklidir.
TRAP bitki araştırmaları için ideal bir araçtır, çünkü birçok gelişimsel süreç hücre duvarı yla ilgili ve mekanik sinyal yollarına dayanır. Lateral kök oluşumunda hücre-hücre iletişimini incelemek için TRAP kullanıyoruz. Kaliteli RNA elde etmek beklediğimiz kadar yalın bir şekilde ortaya çıkmadığı için, bu adım adım video talimatının TRAP uygulanabilirliğini artıracağını ve bu güçlü tekniğin desteklenmesine yardımcı olacağını umuyoruz.
Yayılan homozigot çizgileri sterilize etmek için, 12'ye 12 santimetre kare petri tabaklarına eşit olarak 300 mikrolitreden daha az tohum yayılır ve tabakları 60 litrelik bir kurutucuya dizin. Bir gecede gaz sterilizasyonu sonra, 50 mililitredepolama tüpü içine tohumları toplamadan önce gaz buharlaşmasına izin. Kaplama önce, plaka başına imbibed tohum karışımı bir mililitre elde etmek için% 0.1 agar ile sterilize tohumları seyreltin.
Tohum karışımını kaplamak için, tabak başına üç sıra tohum dikimi için lamine edilmiş bir şablon tutucu oluşturmak için kare Petri kabı kapaklarını kullanın ve boş agar tabaklarını şablon tutucuya yerleştirin. Bir mililitre lik tohumu üç sıra tabak üzerine eşit olarak dağıtın. Ve tohumlar kuruyana kadar, bir laminar akışı nda yığınlar halinde işlenmiş plakalar yerleştirin.
Tohumlar agar yüzeyine yapışmış zaman, kapakları kapatın ve mikropore bant ile her plaka mühür. Arabidopsis köklerinin ilgi çekici bir ajanla eksojen tedavisi için, 1,5 ila iki santimetre genişliğinde, 10 santimetre uzunluğunda, kağıt mendil şeritler hazırlayın. 10 mikromolar NAA doku kağıt ıslatın ve köklerin her satıra kağıt mendil bir şerit uygulamak için cımbız kullanın.
Daha sonra, yavaşça herhangi bir hava kabarcıkları dışarı basın ve plaka dan fazla sıvı boşaltın, zaman ile plaka etiketleme önce. Uygun deneysel bitiş noktasında, kökleri ayırmadan her plakadan kağıt mendil şeritlerini dikkatlice çıkarmak için forcep'ler kullanın ve tek bir kararlı vuruşta, sürgün kökü kavşağı boyunca her satırda bir kez kesmek için cerrahi bir bıçak kullanın. Üç demetleri kökleri toplamak için, her satırın kökleri boyunca kaydırmak için cımbız kullanın.
Ve kökleri sıvı nitrojenle dolu 50 mililitrelik bir tüpe boşaltın, çabuk donma için. Tedavi başına tüm kök örnekleri toplandığında, köklerin dökülmesini önlemek için tüp kapağını kullanarak fazla sıvı nitrojeni decant. Ve tüpü 80 santigrat derece depolamaiçin bir doer kabına yerleştirin.
Doku öğütme ve homojenizasyon için, standart laboratuvar eldivenleri altında pamuklu eldiven giyin ve poliom ekstraksiyon tamponuna PMSF ekleyin. Doku örneğini sıvı nitrojen içeren bir harç içine boşaltın ve tüm malzeme beyaz bir toz olarak görünene kadar dokuları dikkatlice öğütmek için soğutulmuş bir havaneli kullanın. Tüm doku öğütüldüğünde, numuneye beş mililitre poliom ekstraksiyon tamponu ekleyin ve tampon donmadan önce dondurulmuş doku parçalarını tozla hızlı bir şekilde karıştırın.
Karışım aktarılır aktarılabildiği anda, bulamacı buz üzerindeki cam homogenizer boşaltın ve harcı ve havaneliyi durulamak için iki mililitre poliom ekstraksiyon tamponu kullanın. Ekstre homojen olana kadar bulamacı elle öğütün. Daha sonra, buz üzerinde 50 mililitrelik bir santrifüj tüp içine ham kök ekstresi dökün ve gösterildiği gibi bir sonraki örnek süreci.
Toplam RNA koleksiyonu için, her ham numunenin 200 mikrolitrelik aliquotlarını ayrı ayrı temiz, önceden soğutulmuş, etiketli mikrosantrifüj tüplere aktarın. Hücre duvarlarını, enkazları ve büyük organelleri kaldırmak için, numuneleri santrifüj edin ve ikinci bir santrifüj için taze, önceden soğutulmuş konik tüpler içine supernatant decant. Tüpler dönerken, aliquot 60 mikrolitre manyetik GFP boncuk numune başına, bir 1.5 mililitre tüp içine.
Ve tüpü manyetik bir standa yerleştirin, süpernatant kaldırmayı kolaylaştırmak için. Daha sonra, boncukları bir mililitre soğuk yıkama tamponu içinde iki kez yıkayın ve numune başına 60 mikrolitre yıkama tamponu içinde boncukları yeniden askıya alın. Santrifüjden hemen sonra, temizlenmiş süpernatantı etiketli 15 mililitrelik tüplere ayırın ve her numuneye 60 mikrolitre yıkanmış boncuk ekleyin.
Daha sonra, sallanan iki saatlik kuluçka için, bir buz kovası içine yatay olarak tüm örnekleri yerleştirin. Kuluçka sonunda, buz üzerinde manyetik bir stand üzerinde boncuk toplamak ve kalan polizom çıkarma tampon PMSF ekleyin. Süpernatantları attıktan sonra, numunelere yaklaşık beş mililitre polizom çıkarma tamponu ekleyin ve numunelerin içindeki boncukları nazik bir eğimle yeniden askıya alın.
Buz üzerinde shaker üzerinde 15 dakika boyunca sallayın örnekleri, mıknatıs üzerinde taze yıkama tampon ile iki yıkar takip, gösterildiği gibi. Son yıkamadan sonra, 1,5 mililitrelik bir tüp içine, yıkama tampon bir mililitre örnekleri aktarın. Ve tüm supernatant kaldırmak için, manyetik standı üzerinde bir kez daha boncuk toplamak.
Daha sonra, tüm örnekler işlenene kadar buz tüpleri yerleştirin. Laboratuvar malzemelerinin yenilenmesi için, öncelikle tüm ekipmanları kimyasal atıkların içine durula. El iyice her aleti durulama önce, sabun ile harçlar, pestisitler ve homogenizers yıkayın.
Daha sonra, bir ısı güvenli konteyner içinde ekipman yerleştirin ve 220 santigrat derece daha fazla bir gecede malzeme pişirin. Bir jant ve duman kaputu ile otoklav tepsiüzerine tüpler yerleştirmeden önce, deterjan ile temiz santrifüj tüplertüm fırça. Tüplerüzerine bir mililitre sıvı dietil pirokarbonat ve bir litre deiyonize su çözeltisi dökün.
Daha sonra, otoklav tüplerin tepsisterilize önce çözeltitoplamak. Burada GFP sinyalleri ne kadar dır? Propidium iyodür ile karşı boyama hücre duvarı ana hatları işaretler.
Çizgiler endodermislokalizasyon deseni karşılık gelir, ve ksilem-kutup pericycle. Polizom RNA'dan elde edilen bu temsili ölçümlerde, çoğu örnekte 9 ile 10 arasında değişen RNA bütünlüğü sayıları yla çok az bozulma saptandı. Bu grafiklerde, küçültülmüş reaksiyon hacimlerine rağmen, yordamın sağlamlığını vurgulayarak, başarıyla hazırlanmış kitaplıkların izleri gözlemlenebilir.
Genom astarlı bir veri seti üretilmeden önce, bir pilot deneyden TRAP RNA, tedavi başarısını ve/veya deneysel koşulları ve doku özgüllüğünü doğrulamak için kantitatif RTPCR tarafından incelenebilir. Bu analizde, üç yardımcı duyarlı genlerin test tedavi iki saat sonra başarılı bir hormon indüksiyon doğruladı. Sıralama verilerinden alınan dokuya özgü marker gen profilleri hücre tipi özgüllüğünü doğruladı.
RNA ile iş yaparken iyi uygulama tavsiyelerini uygulayın. Steril bir tezgahta çalışın, ekipmanınızı RNA çıkarma solüsyonuyla temizleyin, eldiven giyin ve kirlendiklerinde hemen değiştirin. İşlem sırasında kullanılan tüm toksik kimyasalları ve gazları, özellikle fenol-DEPC klor gazı ve sıvı nitrojeni uygun şekilde kullandığından ve attığından emin olun.
Omik çalışmalar portföyünde, TRAP önemli bir niş kaplar ve zaten birçok biyolojik sorulara cevap için kullanılmıştır, özellikle gelişim biyolojisi, TRAP büyük bir potansiyele sahiptir.
