TRAP을 사용하면 셀룰러 해상도에서 개발 처리를 조사할 수 있습니다. 당사는 세포 형 특이적 프로모터를 사용하여 태그된 리보솜 하위 단위를 구동하고, 거기에서 우리는 다성 RNA를 분리 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 고품질 RNA를 산출하지만 매우 제한된 수량으로 고품질 RNA 라이브러리를 안정적으로 생산하기 위해서는 초저 입력을 전문으로 하는 방법이 필요합니다.
TRAP은 많은 발달 과정이 세포 벽 관련 및 기계적 신호 경로에 의존하기 때문에 식물 연구에 이상적인 도구입니다. 우리는 말기 뿌리 형성에서 세포 세포 통신을 연구하기 위해 TRAP을 사용합니다. 좋은 품질의 RNA를 얻는 것이 우리가 예상했던 것처럼 똑바로 앞으로 증명으로, 우리는이 단계별 비디오 교육이 TRAP 적용성을 증가하고이 강력한 기술을 촉진하는 데 도움이 되기를 바랍니다.
전파된 호모지구스 라인을 살균하기 위해 12-12센티미터 제곱 페트리 접시에 300 마이크로리터 미만의 씨앗을 고르게 펴고 60리터 데시케이터에 접시를 쌓아 놓습니다. 하룻밤 동안 가스 살균 후, 50 밀리리터 저장 튜브로 씨앗을 수집하기 전에 가스가 증발하자. 도금 하기 전에, 멸균 된 씨앗을 0.1%의 천으로 희석하여 플레이트 당 1 밀리리터의 씨앗 믹스를 얻습니다.
씨앗 믹스를 접시에 담아, 사각형 페트리 접시 뚜껑을 사용하여 접시 당 세 줄의 씨앗을 심기위한 적층 템플릿 홀더를 만들고 빈 한천 판을 템플릿 홀더에 놓습니다. 3열의 접시에 고균하게 임비드 씨앗1밀리리터를 분배합니다. 그리고 가공 된 플레이트를 라미나르 흐름에 쌓아 놓고 씨앗이 건조 할 때까지 놓습니다.
씨앗이 한천 표면에 붙어있을 때 뚜껑을 닫고 각 접시에 마이크로 포어 테이프로 밀봉하십시오. 관심있는 에이전트를 가진 아라비도시스 뿌리의 외인성 처리를 위해, 조직 종이의 1.5 에서 2 센티미터 너비, 10 센티미터 길이, 스트립을 준비하십시오. 10 마이크로 몰라 NAA에 티슈 페이퍼를 담그고 핀셋을 사용하여 각 뿌리 줄에 티슈 페이퍼 스트립을 적용하십시오.
그런 다음, 거품을 부드럽게 누르고 접시에서 여분의 액체를 비우고 접시에 라벨을 붙입니다. 적절한 실험 종점에서는 포셉을 사용하여 뿌리를 분리하지 않고 각 플레이트에서 티슈 페이퍼 스트립을 조심스럽게 제거하고 수술용 블레이드를 사용하여 촬영 루트 접합을 따라 행당 한 번 절단하여 단일 결정된 스트로크로 절단합니다. 핀셋을 사용하여 각 행의 뿌리를 따라 스 와이프하여 세 번들로 뿌리를 수집합니다.
그리고 액체 질소로 채워진 50 밀리리터 튜브에 뿌리를 비우고, 스냅 동결을 위해. 치료당 모든 루트 샘플을 채취하면, 튜브 뚜껑을 사용하여 과도한 액체 질소를 데산하여 뿌리가 유출되는 것을 방지한다. 그리고 80섭씨 저장을 위해 튜브를 도어 용기에 넣습니다.
조직 연삭 및 균질화를 위해 표준 실험실 장갑 아래에 면 장갑을 착용하고 다각성 추출 버퍼에 PMSF를 추가하십시오. 액체 질소를 포함하는 박격포에 조직 샘플을 비우고, 모든 물질이 백색 분말로 나타날 때까지 조심스럽게 조직을 분쇄하기 위해 냉각 된 유봉을 사용합니다. 모든 조직이 분쇄되면, 샘플에 폴리좀 추출 버퍼의 5 밀리리터를 추가하고 버퍼가 정지하기 전에 분말과 냉동 조직 조각을 신속하게 혼합합니다.
혼합물을 옮길 수 있는 즉시 슬러리를 얼음 의 유리 균질화제로 비우고 폴리오톤 추출 버퍼의 2밀리리터를 추가하여 박격포와 유봉을 헹구는다. 추출물이 균일할 때까지 슬러리를 수동으로 갈아. 그런 다음, 얼음에 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 조루 뿌리 추출물을 붓고, 입증된 대로 다음 샘플을 처리한다.
총 RNA 수집을 위해 각 원유 샘플의 200 마이크로리터 알리쿼트를 개별 깨끗하고 미리 냉각된 마이크로센심분리기 튜브로 이송합니다. 세포벽, 파편 및 대형 세포기관을 제거하려면 샘플을 원심분리하고 두 번째 원심분리를 위해 미리 냉각된 신선한 원뿔 튜브로 상류관을 제거합니다. 튜브가 회전하는 동안, 시료 당 자기 GFP 구슬의 60 마이크로 리터를 1.5 밀리리터 튜브로 알리쿼트합니다.
그리고 상체 제거를 용이하게하기 위해, 자기 스탠드에 튜브를 배치합니다. 이어서, 워시당 냉세척 버퍼 1밀리리터로 구슬을 2회 세척하고, 시료당 60마이크로리터의 세척 버퍼로 구슬을 다시 정지시한다. 원심 분리 직후, 클리어된 상체를 15밀리리터 튜브로 장식하고 각 샘플에 60 마이크로리터의 세척구를 추가합니다.
그런 다음 모든 샘플을 얼음 양동이에 수평으로 넣고 흔들어 두 시간 동안 잠식합니다. 인큐베이션이 끝나면 얼음 위에 있는 자기 스탠드에 구슬을 수집하고 나머지 다편 추출 버퍼에 PMSF를 추가합니다. 수퍼나티를 폐기한 후, 샘플에 약 5밀리리터의 다일부 추출 버퍼를 추가하고 부드러운 기울기로 샘플 내에서 구슬을 다시 일시 중단합니다.
얼음에 셰이커에 15 분 동안 샘플을 바위, 다음 자석에 신선한 세척 버퍼와 두 세척, 입증 된 바와 같이. 마지막 세척 후, 세척 버퍼의 1 밀리리터에 샘플을 전송, 1.5 밀리리터 튜브로. 그리고 모든 상체를 제거하기 위해 자기 스탠드에서 구슬을 한 번 더 수집합니다.
그런 다음 모든 샘플이 처리될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 실험실 소모품의 재조정을 위해 먼저 모든 장비를 화학 폐기물로 헹구는 것입니다. 각 기기를 완전히 헹구기 전에 박격포, 유봉 및 균질화제를 비누로 손 씻으십시오.
다음으로 장비를 열에 안전한 용기에 넣고 밤새 220도 이상의 고리에서 재료를 굽습니다. 모든 원심분리기 튜브를 세제로 깨끗하게 닦은 후, 튜브를 림과 연기 후드가 있는 자동 복제 가능한 트레이에 놓습니다. 액체 다이틸 파이로카보네이트 1밀리리터와 1리터의 탈이온화된 용액을 튜브에 3~18시간 동안 붓습니다.
그런 다음 오토클레이브에서 튜브 트레이를 살균하기 전에 용액을 수집합니다. 여기서, GFP 신호가 있는 대표적인 식물이 표시됩니다. 프로피듐 요오드로 염색하는 것은 세포벽 윤곽을 표시합니다.
선은 내도피의 국소화 패턴및 자일렘 극 pericycle에 해당합니다. 다각성 RNA에서 얻은 이 대표적인 측정에서, 대부분의 견본은 9에서 10에 구역 수색하는 RNA 무결성 수와 아주 작은 저하를 보여주었습니다. 이러한 그래프에서는 성공적으로 준비된 라이브러리의 흔적을 관찰하여 축소된 반응 볼륨에도 불구하고 절차의 견고성을 강조할 수 있습니다.
게놈 에걸레를 배합한 데이터 세트가 생성되기 전에, 파일럿 실험에서 TRAP RNA는 정량적 RTPCR에 의해 조사되어 치료 성공 및/또는 실험 조건뿐만 아니라 조직 특이성을 검증할 수 있다. 이 분석에서, 3개의 auxin 반응성 유전자의 시험은 처리의 2 시간 후에 성공적인 호르몬 유도를 확인했습니다. 시퀀싱 데이터로부터 회수된 조직 특이적 마커 유전자 프로파일은 세포 형 특이성을 확인하였다.
RNA를 다룰 때 좋은 연습 조언을 따르십시오. 멸균 벤치에서 일하고 RNA 제거 용액으로 장비를 청소하고 장갑을 착용하고 오염되면 즉시 교체하십시오. 특히 페놀-DEPC 염소 가스 및 액체 질소, 절차 중에 사용 되 었던 모든 독성 화학 물질 및 가스를 적절히 처리하고 폐기하십시오.
omic 연구의 포트폴리오에서 TRAP은 중요한 틈새 시장을 차지하고 있으며, 이미 많은 생물학적 질문에 대답하는 데 사용되어 왔으며, 특히 발달 생물학에서 TRAP은 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다.
