פרוטוקול זה עוזר לנו להבין כיצד התנהגות ציטוסקלטון Microtubule מתרחשת בצמחים. יחד עם זאת, זה גם עוזר לנו להבין כיצד רכיבים מבניים אלה המשפיעים על צורת התאים והאיברים, מגיבים לשינויים בכוחות מכניים. אמנם, שיטה זו דורשת תחכום מועט, היא מספקת חזק, כמותי לקרוא אחרי, הבדלי התגובה המכנית בין genotypes שונים ותנאים.
התחל בגידול זרעי arabidopsis המבטאת תחומים מחייבים microtubule התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק באדמה, ב 20 ו 6 מעלות צלזיוס בתנאי יום ארוכים במשך שבוע. לאחר הנביטה, מעבירים את השתילים לסירים חדשים עם מרחב צמיחה מספיק כדי לאפשר צמיחה צמחית חזקה, וממקמים את הצמחים ב 20 ו 16 מעלות צלזיוס בתנאי יום קצרים. לאחר שלושה עד חמישה שבועות, מעבירים את הצמחים בחזרה לתנאי יום ארוכים באותה טמפרטורה עד שהצמחים בורחים, ומאפשרים לתפרחת לגדול עד לאורך של שניים עד חמישה סנטימטרים.
עבור לירות Apical Meristem dissection, לשים את תפרחת, ולהשתמש מלקחיים חדים לקלף את הפרחים בבסיס של peduncles, עד שקשה לראות את peduncles עם עין בלתי כדי להסיר את ניצני הפרחים הישנים. השתמש במקלות כדי ליצור חריץ אגרוס בצלחת חיטוי, ולשתול את בסיס תפרחת לתוך Augur עבה. מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ נותח.
החל ניצן הפרח העתיק ביותר, לדחוף עם המדפים כדי להסיר את ניצן הפרח מן הצמח. מריסטם apical לירות נחשף בדרך כלל כאשר פרחים ישנים עד שלב שש עד שבע מוסרים. ולהשתמש במקלות כדי לדחוף כל ניצן פרח למטה עד מריסטם apical לירות גלוי.
ברגע שהריסתם האפורית תיחשף, תן למדגם הטרי לנתח את מדיום הצמיחה בקופסת תרבות צירי פלסטיק מלבנית מעקרת אתנול עם מריסטם אפיקל לירות רק חשוף מעל פני השטח הבינוניים. מוסיפים כמה טיפות של מים סטריליים deionized לקצוות של תיבת התרבות ולסגור את המכסה כדי לשמור על הלחות בתוך התיבה. עוטפים את הקופסה בקלטת מיקרופור, וממקמים את תיבת הגידול בתנאי יום ארוכים או רציפים ב-22 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 24 שעות.
כאשר הצמח התאושש מהליך הניתוח, לכסות את המדגם עם מים סטריליים deionized ולבדוק בועות אוויר תחת מיקרוסקופ ניתוח. העבר את תיבת התרבות לשלב מיקרוסקופ קונפוקל זקוף, ובחר את עדשת טבילת המים 40 או 60X. מנמיך את המטרה לתוך המים ולבדוק בועות אוויר על העדשה הקדמית של האובייקט.
כדי להסיר בועות, להוריד את הבמה בעדינות לנגב את העדשה עם רקמה אופטית. לאחר מכן השתמש פיפטה פסטר להוסיף נפח קטן של מים לעדשה הקדמית של המטרה לפני מחדש לטבול את העדשה במים. לאחר מכן, השתמש במסנן GFP ובמודול תאורת האפי-אפיון של המיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לכוונן את בקר ה- XY כדי לאתר את הדגימה.
התאמת המיקום של העין, למקם את meristem apical לירות ישירות מתחת למקור האור, ולהתמקד לאורך ציר Z עד לשיא ממוקם. השתמש בלייזר המסוגל להאיר את הדגימה, ולהתאים את הזום האופטי של המיקרוסקופ, כך שהמריסטם האפורי כולו והפרימורדיה הפרחונית בשלב הראשון נמצאים בשדה המבט. לאחר מכן, התאימו את העוצמה של פלט הלייזר ואת הגדרות הרווח כדי לקבל יחס אות אופטימלי לרעש.
לאחר מתן אפשרות לדגימה להסתפק בשתיים עד חמש דקות, רכוש ערימות קונפוקל Z של המדגם במרווחי פרוסת Z של 0.25 עד 0.5 מיקרומטר, והוסיף כ- 0.3 מיקרו פיקסלים בגודל רזולוציה. בסיום הרכישה, יש לפנות מיד את המים ולהעביר את קופסת התרבות בחזרה לתא הצמיחה. עבור Micromechanical לירות Apical Meristem Perturbation, לרכוש ערימות תמונה טרום אבלציה של ארגון microtubule קליפת המוח כפי שהוכח רק, ו decaf את המים מתיבת התרבות לתוך צלחת תרבות.
העבר את מריסטם apical לירות תחת מיקרוסקופ ניתוח, ולאט לאט התקרב meristem אשוחית לירות עם מחט מזרק נקי 0.4 על ידי 20 מילימטר. צרו קשר בקצרה עם הפריפריה של כיפת הכיפה עם קצה המחט כדי לאשר שהאבלציה הושלמה. ול מילוי צלחת התרבות במים סטריליים.
לאחר מכן מוסיפים 10 מיקרוגרם למיליליטר של פרופידיום יודיד למנה ומיד לרכוש ערימות תמונה כפי שהוכח כל שעתיים במשך שש שעות, להחזיר את צלחת התרבות הדגירה בין כל נקודת זמן. לניתוח נתונים, ליצור תחזיות פני השטח של ערימות התמונה באמצעות תוכנה לניתוח תמונה מתאימה, ולבצע חילוץ של אניסוטרופיה microtubule קליפת המוח באמצעות מאקרו כלי Fibril בפיג'י. כאן, תמונות הקרנה טיפוסיות המתקבלות מקווי GFP של תחום איגוד microtubule עם תאים במרכז הכיפה המכילים microtubules קליפת המוח לא מאורגנת, תאים בפריפריה, בעל התפלגות היקפית ותאי תחום גבול המכיל microtubules קליפת המוח מיושר במקביל הציר הארוך של התא ניתן לראות.
דימות זמן לשגות, מראה יישור microtubule קליפת המוח משתנה ממערך הפרעה מאוד למערך מאורגן יותר בתוך שש שעות של אבלציה. טנטורים יכולים להיות מובלטים על תמונות microtubule קליפת המוח, ואת המידע שחולץ יכול להיות מיוצג על ידי התוויית anisotropy הממוצע לאורך זמן. בעת התאמת כוח פלט לייזר ולקבל הגדרות, אנחנו צריכים להבטיח את זה תצפית ברורה של תריסים ולנסות למנוע overexposure, כמו מעל אותות רוויים יכול להטות את כיוון מתיחה בניתוח מאוחר יותר.
מיקרוסקופ כוח אטומי יכול להתבצע גם כדי להעריך כיצד השינויים בכוחות המכניים למעשה משפיעים על המצב הפיזי של קיר התא.
