Ce protocole nous aide à comprendre comment le comportement microtubule cytosquelette se produit dans les plantes. En même temps, il nous aide également à comprendre comment ces composants structurels qui influencent la forme des cellules et des organes, réagissent aux changements des forces mécaniques. Bien que cette méthode exige peu de sophistication, elle fournit robuste, quantitative lecture après, les différences de réponse mécanique entre les différents génotypes et conditions.
Commencez par cultiver des graines d’arabidopsis exprimant des domaines de liaison microtubule fusionnés avec des protéines fluorescentes vertes dans le sol, à 20 et 6 degrés Celsius dans de longues conditions de jour pendant une semaine. Après la germination, transférer les semis dans de nouveaux pots avec suffisamment d’espace de croissance pour permettre une croissance végétative robuste, et placer les plantes à 20 et 16 degrés Celsius dans de courtes conditions de jour. Après trois à cinq semaines, remettre les plantes à de longues conditions de jour à la même température jusqu’à ce que les plantes boulon, permettant à l’inflorescence de croître jusqu’à deux à cinq centimètres de long.
Pour tirer apical meristem dissection, putt l’inflorescence, et utiliser des forceps pointus pour peler les fleurs à la base des péduncles, jusqu’à ce qu’il soit difficile de voir les péduncles à l’œil nu pour enlever les bourgeons floraux plus âgés. Utilisez les forceps pour créer une fente dans les agros dans un plat disséquant, et plantez la base d’inflorescence dans l’épais Augure. Placer le plat sous un microscope disséquant.
En commençant par le plus vieux bourgeon de fleur, poussez avec les forceps pour enlever le bourgeon de fleur de la plante. Le meristem apical de pousse est habituellement exposé quand les fleurs plus anciennes jusqu’au stade six à sept sont enlevées. Et utilisez les forceps pour pousser chaque bourgeon de fleur vers le bas jusqu’à ce que le meristem apical de pousse soit visible.
Dès que le meristem apical de pousse est exposé, laissez l’échantillon fraîchement disséqué dans le milieu de croissance dans une boîte rectangulaire rectangulaire de culture articulée en plastique éthanol-stérilisée avec le meristem apical de pousse juste exposé au-dessus de la surface moyenne. Ajouter quelques gouttes d’eau déionisée stérile sur les bords de la boîte de culture et fermer le couvercle pour maintenir l’humidité à l’intérieur de la boîte. Enveloppez la boîte avec du ruban micropore et placez la boîte de croissance dans des conditions de jour longues ou continues à 22 degrés Celsius pendant 12 à 24 heures.
Lorsque la plante s’est remise de la procédure de dissection, recouvrez l’échantillon d’eau déionisée stérile et vérifiez s’il y a des bulles d’air sous le microscope à disséquer. Transférez la boîte de culture à un stade de microscope confocal droit, et sélectionnez l’objectif de trempage d’eau 40 ou 60X. Abaissez l’objectif dans l’eau et vérifiez s’il y a des bulles d’air sur la lentille avant de l’objet.
Pour enlever les bulles, abaissez le stade et essuyez doucement la lentille avec un tissu optique. Ensuite, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter un petit volume d’eau à la lentille avant de l’objectif avant de re-immerser la lentille dans l’eau. Ensuite, utilisez le filtre GFP et le module d’épi-illumination du microscope confocal pour régler le contrôleur XY pour localiser l’échantillon.
Ajuster la position des oculaires, positionner le meristem apical de tir directement sous la source lumineuse, et se concentrer le long de l’axe Z jusqu’à ce que l’apex soit localisé. Utilisez un laser capable de gfp passionnant pour éclairer l’échantillon, et ajuster le zoom optique du microscope, de sorte que l’ensemble de la pousse meristem apical et la première étape primordia florale sont dans le champ de vision. Ensuite, ajustez la puissance de la sortie laser et les paramètres de gain pour obtenir un rapport signal/bruit optimal.
Après avoir permis à l’échantillon de se contenter de deux à cinq minutes, acquérir des piles de Z confoccales de l’échantillon à des intervalles de 0,25 à 0,5 micromètres de tranche Z, ajoutant une résolution de taille de pixel d’environ 0,3 micromètre. À la fin de l’acquisition, retirez immédiatement l’eau et transférez la boîte de culture à la chambre de croissance. Pour Micromechanical Shoot Apical Meristem Perturbation, acquérir des piles d’images de pré-ablation de l’organisation corticale microtubule comme nous venons de le démontrer, et décaféiné l’eau de la boîte de culture dans un plat de culture.
Transférer le meristem apical de pousse sous un microscope disséquant, et lentement approché le meristem apical de pousse avec une aiguille propre de seringue de 0,4 par 20 millimètres. Contactez brièvement la périphérie du dôme du meristem apical de pousse avec la pointe d’aiguille pour confirmer que l’ablation a été accomplie. Et remplissez le plat de culture avec de l’eau déionisée stérile.
Ajoutez ensuite 10 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium au plat et acquérez immédiatement des piles d’images comme démontré toutes les deux heures pendant six heures, renvoyant le plat de culture à l’incubation entre chaque point de temps. Pour l’analyse des données, générer des projections de surface des piles d’images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image approprié, et effectuer l’extraction de l’anisotropie corticale microtubule à l’aide de la Macro Outil Fibril aux Fidji. Ici, des images de projection typiques obtenues à partir de lignes GFP de liaison de microtubule avec des cellules au centre du dôme contenant des microtubules corticals désorganisés, des cellules à la périphérie, ayant une distribution circonférentielle et des cellules de domaine de limite contenant des microtubules corticals alignés parallèlement au long axe de la cellule peuvent être observées.
L’imagerie time-lapse, montre l’alignement cortical de microtubule changeant d’un tableau fortement désordonné à un tableau plus organisé dans les six heures suivant l’ablation. Tensors pourrait être superposé sur les images corticales de microtubule, et l’information extraite pourrait être représentée en traçant l’anisotropie moyenne au fil du temps. Lors de l’ajustement de la puissance de sortie laser et des paramètres de gain, nous devrions nous assurer qu’il observation claire des filaments et essayer d’éviter la surexposition, comme les signaux saturés plus pourrait biaiser la direction tendue dans l’analyse ultérieure.
La microscopie de la force atomique peut également être effectuée pour évaluer comment les changements dans les forces mécaniques affectent réellement l’état physique de la paroi cellulaire.
