Questo protocollo ci aiuta a capire come il comportamento del citoscheletro microtubulo si verifica nelle piante. Allo stesso tempo, ci aiuta anche a capire come questi componenti strutturali che influenzano la forma cellulare e dell'organo, rispondono ai cambiamenti nelle forze meccaniche. Sebbene questo metodo richieda poca raffinatezza, fornisce un read-after robusto e quantitativo, le differenze di risposta meccanica tra diversi genotipi e condizioni.
Inizia coltivando semi di arabidopsis che esprimono domini di legame di microtubuli fusi con proteine fluorescenti verdi nel terreno, a 20 e 6 gradi Celsius in condizioni di lunga giornata per una settimana. Dopo la germinazione, trasferire le piantine in nuovi vasi con spazio di crescita sufficiente per consentire una robusta crescita vegetativa e posizionare le piante a 20 e 16 gradi Celsius in condizioni di breve giorno. Dopo tre o cinque settimane, trasferire le piante alle condizioni di lunga giornata alla stessa temperatura fino a quando le piante non si imbullonano, consentendo all'infiorescenza di crescere fino a due o cinque centimetri di lunghezza.
Per la dissezione meristem apicale shoot, mettere l'infiorescenza e usare pinze affilate per sbucciare i fiori alla base dei peduncoli, fino a quando non è difficile vedere i peduncoli ad occhio nudo per rimuovere i boccioli di fiori più vecchi. Utilizzare le forcep per creare una fessura negli agro in un piatto di sezionazione e piantare la base di infiorescenza nello spesso Augur. Posizionare il piatto al microscopio di sezionamento.
A partire dal bocciolo di fiori più antico, spingere con le flessce per rimuovere il bocciolo di fiori dalla pianta. Il meristem apicico del germoglio è solitamente esposto quando i fiori più vecchi fino allo stadio da sei a sette vengono rimossi. E usa le forcep per spingere ogni bocciolo di fiori verso il basso fino a quando il meristem apicali del germoglio è visibile.
Non appena viene esposto il meristem apicico shoot, lasciare che il campione appena sezionato in mezzo di crescita in una scatola di coltura rettangolare incernierata in plastica sterilizzata con etanolo con il meristem apicico di germogli appena esposto sopra la superficie media. Aggiungere alcune gocce di acqua deionizzata sterile ai bordi della scatola di coltura e chiudere il coperchio per mantenere l'umidità all'interno della scatola. Avvolgere la scatola con nastro micropore e posizionare la scatola di crescita in condizioni di giorno lunghe o continue a 22 gradi Celsius per 12-24 ore.
Quando l'impianto si è ripreso dalla procedura di dissezione, coprire il campione con acqua deionizzata sterile e verificare la presenza di bolle d'aria al microscopio di sezionamento. Trasferire la scatola delle impostazioni cultura su uno stadio di microscopio confocale verticale e selezionare l'obiettivo di immersione in acqua 40 o 60X. Abbassare l'obiettivo nell'acqua e verificare la presenza di bolle d'aria sull'obiettivo anteriore dell'oggetto.
Per rimuovere le bolle, abbassare lo stadio e pulire delicatamente l'obiettivo con un tessuto ottico. Quindi utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere un piccolo volume d'acqua alla lente anteriore dell'obiettivo prima di immergere di nuovo l'obiettivo nell'acqua. Successivamente, utilizzare il filtro GFP e il modulo di epi-illuminazione del microscopio confocale per regolare il controller XY per localizzare il campione.
Regolando la posizione dell'oculare, posizionare il meristem apicale di ripresa direttamente sotto la sorgente luminosa e mettere a fuoco lungo l'asse Z fino a quando l'apice non si trova. Utilizzare un laser in grado di eccitanti GFP per illuminare il campione e regolare lo zoom ottico del microscopio, in modo che l'intero meristem apicali di ripresa e il primordia floreale di fase uno siano nel campo visivo. Quindi, regolare la potenza dell'uscita laser e le impostazioni di guadagno per ottenere un rapporto segnale/rumore ottimale.
Dopo aver permesso al campione di depositarsi per due o cinque minuti, acquisire pile Z confocali del campione a intervalli di fette Z da 0,25 a 0,5 micrometri, aggiungendo una risoluzione delle dimensioni dei pixel di circa 0,3 micrometri. Al termine dell'acquisizione, rimuovere immediatamente l'acqua e trasferire la scatola di coltura nella camera di crescita. Per micromeccanica Shoot Apical Meristem Perturbation, acquisire pile di immagini di pre-ablazione dell'organizzazione dei microtubuli corticali come appena dimostrato e decompilare l'acqua dalla scatola della coltura in un piatto di coltura.
Trasferire il meristem apicico di ripresa al microscopio sezionato e avvicinarsi lentamente al meristem apicico del germoglio con un ago pulito da 0,4 a 20 millimetri. Contattare brevemente la periferia della cupola del meristem apicali del germoglio con la punta dell'ago per confermare che l'ablazione è stata completata. E riempire il piatto di coltura con acqua deionizzata sterile.
Quindi aggiungere 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio al piatto e acquisire immediatamente pile di immagini come dimostrato ogni due ore per sei ore, restituendo il piatto di coltura all'incubazione tra ogni punto di tempo. Per l'analisi dei dati, generare proiezioni superficiali degli stack di immagini utilizzando un programma software di analisi delle immagini appropriato ed eseguire l'estrazione dell'anisotropia del microtubulo corticale utilizzando fibril tool macro nelle Fiji. Qui, si possono osservare immagini di proiezione tipiche ottenute da linee GFP di dominio di legame microtubulo con cellule al centro della cupola contenenti microtubuli corticali disorganizzati, cellule alla periferia, con distribuzione circonferenziale e cellule di dominio limite contenenti microtubuli corticali allineati parallelamente al lungo asse della cellula.
L'imaging time-lapse, mostra l'allineamento corticale dei microtubuli che cambia da un array altamente disordinato a un array più organizzato entro sei ore dall'ablazione. I tensori potrebbero essere sovrapposti alle immagini dei microtubuli corticali, e le informazioni estratte potrebbero essere rappresentate tracciando l'anisotropia media nel tempo. Quando si regolano le impostazioni di potenza e guadagno dell'uscita laser, dovremmo garantire un'osservazione chiara dei filamenti e cercare di evitare la sovraesposizione, poiché segnali saturi potrebbero polarizzarsi la direzione della trazione in analisi successive.
La microscopia a forza atomica può anche essere eseguita per valutare come i cambiamenti nelle forze meccaniche influenzino effettivamente lo stato fisico della parete cellulare.
