Этот протокол помогает нам понять, как microtubule Cytoskeleton поведение происходит в растениях. В то же время, это также помогает нам понять, как эти структурные компоненты, которые влияют на форму клеток и органов, реагируют на изменения в механических силах. Хотя этот метод требует небольшой сложности, он обеспечивает надежные, количественные чтения после, механические различия реакции между различными генотипами и условиями.
Начните с выращивания семян арабидопсиса, выражают микротрубочки, связывающие домены, слитые с зеленым флуоресцентным белком в почве, при 20 и 6 градусах по Цельсию при длительных дневных условиях в течение одной недели. После прорастания, передать саженцы в новые горшки с достаточным пространством роста, чтобы обеспечить устойчивый вегетативный рост, и место растений на 20 и 16 градусов по Цельсию в условиях короткого дня. Через три-пять недель, передать растения обратно в длинные условия дня при той же температуре, пока растения болт, что позволяет соцветия расти до двух-пяти сантиметров в длину.
Для стрелять Apical Meristem вскрытия, положить соцветия, и использовать острые миппы, чтобы очистить цветы у основания peduncles, пока не трудно увидеть peduncles невооруженным глазом, чтобы удалить старые почки цветка. Используйте типсы, чтобы создать щель в агро в рассечении блюдо, и посадить соцветия базы в толстый augur. Поместите блюдо под рассечение микроскопа.
Начиная с старейшего цветочного бутона, нажмите с типсами, чтобы удалить цветок бутон с растения. Стрелять апический меристем, как правило, подвергаются, когда старые цветы до этапа от шести до семи удаляются. И использовать типсы, чтобы подтолкнуть каждый цветок бутон вниз, пока стрелять апический меристем виден.
Как только стрелять apical meristem подвергается, пусть свежевыпаренный образец в среде роста в этанола стерилизованных прямоугольных пластиковых навесной культуры поле с стрелять апический меристем просто подвергаются над средней поверхности. Добавьте несколько капель стерильной деионизированной воды к краям коробки культуры и закройте крышку для поддержания влажности внутри коробки. Оберните коробку с помощью микропорной ленты и поместите коробку роста в длинные или непрерывные дневные условия при 22 градусах по Цельсию в течение 12-24 часов.
Когда растение оправилось от процедуры вскрытия, накройте образец стерильной деионизированной водой и проверьте наличие пузырьков воздуха под рассеченным микроскопом. Перенесите культурную коробку на вертикальную стадию конфокального микроскопа и выберите 40 или 60X окунающий объектив для погружения воды. Опустите цель в воду и проверьте наличие пузырьков воздуха на передней линзе объекта.
Чтобы удалить пузырьки, опустите сцену и аккуратно протрите объектив оптической тканью. Затем используйте пипетки Pasteur, чтобы добавить небольшой объем воды в переднюю линзу цели, прежде чем повторно погрузить объектив в воду. Затем используйте фильтр GFP и модуль эпи-освещения конфокального микроскопа, чтобы настроить контроллер XY, чтобы найти образец.
Регулируя положение глаз, располагайте стрелять апический меристем непосредственно под источником света, и сосредоточьтесь вдоль оси З до тех пор, пока вершина не будет расположена. Используйте лазер, способный захватывающих GFP для освещения образца, и настроить оптический зум микроскопа, так что весь стрелять апический меристем и первый этап цветочные имордии находятся в поле зрения. Затем отрегулируйте мощность лазерного выхода и настройки усиления, чтобы получить оптимальное отношение сигнала к шуму.
После того, как образец будет осесть в течение двух-пяти минут, приобрети конфокальные стеки образца с интервалом от 0,25 до 0,5 микрометра, добавив примерно 0,3 микрометра разрешения размера пикселей. В конце приобретения немедленно удалите воду и перенесите коробку культуры обратно в камеру роста. Для Micromechanical Shoot Apical Meristem Perturbation приобретайте доабляционные изображения стеков корковой организации микротрубочек, как только что продемонстрировано, и без кофеина воду из коробки культуры в культурное блюдо.
Передача стрелять апический меристем под рассечение микроскопа, и медленно подошел стрелять апикал меристем с чистой 0,4 на 20 миллиметров шприц иглы. Кратко свяжитесь с периферией купола стрелять апический меристем с кончиком иглы, чтобы подтвердить, что абляция была завершена. И пополнить культуру блюдо стерильной деионизированной водой.
Затем добавьте 10 микрограммов на миллилитр йодида пропидия в блюдо и сразу же приобрести изображения стеки, как помещено каждые два часа в течение шести часов, возвращая культуру блюдо инкубации между каждой точкой времени. Для анализа данных генерируйте поверхностные проекции стеков изображений с помощью соответствующей программы анализа изображений и выполняйте извлечение анисотропии корковых микротрубочек с помощью Fibril Tool Macro на Фиджи. Здесь можно наблюдать типичные проекционные изображения, полученные из микротрубочек, связывающих линии GFP домена с ячейками в центре купола, содержащими дезорганизованные корковые микротрубочные микротрубочные, клетки на периферии, имеющие окружное распределение и пограничные клетки домена, содержащие корковые микротрубочные элементы, выровненные параллельно длинной оси клетки.
Промежуточная визуализация показывает выравнивание корковых микротрубочек, меняющихся от сильно неупорядоченные массивы к более организованному массиву в течение шести часов после абляции. Тенсоры могут быть наложены на корковые микротрубочные изображения, а извлеченная информация может быть представлена путем построения анисотропии со временем. При регулировке мощности лазерной мощности и настройки усиления, мы должны обеспечить четкое наблюдение за нитей и попытаться избежать чрезмерного воздействия, так как более насыщенные сигналы могут смещения напряженного направления в более позднем анализе.
Атомная силовая микроскопия также может быть выполнена для оценки того, как изменения в механических силах на самом деле влияют на физическое состояние клеточной стенки.
