이 프로토콜은 식물에서 미세 투튜룰 세포 골격 의 행동이 어떻게 발생하는지 이해하는 데 도움이됩니다. 동시에, 그것은 또한 우리가 세포와 장기 모양에 영향을 미치는 이러한 구조 구성 요소를 이해하는 데 도움이, 기계적 힘의 변화에 반응. 이 방법은 정교함이 거의 필요하지 않지만, 서로 다른 유전자형과 조건 간의 기계적 반응 차이를 강력하고 정량적 읽기 후에 제공합니다.
토양에서 녹색 형광 단백질과 융합된 미세투불 결합 영역을 발현하는 애기장종 씨앗을 1주일 동안 긴 낮 조건하에서 섭씨 20도, 6도에서 발현하는 것으로 시작합니다. 발아 후, 모종을 강력한 식물 성장을 허용하기에 충분한 성장 공간을 가진 새로운 냄비로 옮기고, 짧은 낮 조건하에서 식물을 섭씨 20도와 16도에 배치하십시오. 3~5주 후, 식물이 볼트가 될 때까지 같은 온도에서 긴 하루 조건으로 식물을 옮기면 꽃피는 최대 2~5cm까지 자랄 수 있습니다.
촬영 Apical 메리스템 해부를 위해, 꽃을 퍼트하고, 오래된 꽃 봉오리를 제거하기 위해 육안으로 페다클을 보기 어려울 때까지, 페단의 기지에서 꽃을 벗겨 날카로운 집게를 사용합니다. 집게를 사용하여 해부 접시에 농경에 슬릿을 만들고, 두꺼운 Augur에 꽃 기초를 심는다. 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다.
가장 오래된 꽃 봉오리로 시작하여 집게로 밀어 식물에서 꽃 봉오리를 제거하십시오. 촬영 apical 메리스템은 일반적으로 6~7단계까지 의 오래된 꽃을 제거할 때 노출됩니다. 그리고 촬영 apical 메리 스템이 볼 때까지 아래로 각 꽃 싹을 밀어 집게를 사용합니다.
촬영 에원골-살균직 플라스틱 힌지 배양 박스에 있는 생후 저술된 메리스템이 노출되는 즉시 중간 표면 위에 노출된 촬영 에탄올-살균직 플라스틱 힌지 컬쳐 박스에서 갓 해부된 시료를 보자. 배양 상자의 가장자리에 멸균 된 물 몇 방울을 추가하고 상자 내부의 습도를 유지하기 위해 뚜껑을 닫습니다. 마이크로포어 테이프로 상자를 감싸고 성장 상자를 섭씨 22도에서 24시간 동안 섭씨 22도에 낮게 유지합니다.
식물이 해부 절차에서 회복되면, 멸균 탈온 된 물로 샘플을 덮고 해부 현미경에서 기포를 확인하십시오. 배양 상자를 똑바로 공초점 현미경 단계로 옮기고 40 또는 60X 물 침지 렌즈를 선택합니다. 목표를 물에 낮추고 물체의 전면 렌즈에서 기포를 확인합니다.
거품을 제거하려면 스테이지를 낮추고 광학 조직으로 렌즈를 부드럽게 닦습니다. 그런 다음 파스퇴르 파이펫을 사용하여 렌즈를 물에 다시 몰입하기 전에 목표의 전면 렌즈에 소량의 물을 추가합니다. 다음으로, 공초점 현미경의 GFP 필터 및 에피 조명 모듈을 사용하여 XY 컨트롤러를 조정하여 샘플을 찾습니다.
안구의 위치를 조정하고, 촬영 정황 메리스템을 광원 바로 아래에 배치하고, 정점을 위치할 때까지 Z축을 따라 집중한다. 흥미로운 GFP가 가능한 레이저를 사용하여 시료를 비추고 현미경의 광학 줌을 조정하여 전체 촬영 에액어 메리스템과 스테이지 1 꽃 프리모르디아가 시야에 있습니다. 그런 다음 레이저 출력의 전력과 게인 설정을 조정하여 잡음 비율에 대한 최적의 신호를 얻습니다.
시료가 2~5분 동안 정착할 수 있게 한 후, 샘플의 공초점 Z 스택을 0.25 내지 0.5 마이크로미터 Z 슬라이스 간격으로 획득하여 약 0.3 마이크로 미터 크기의 해상도를 추가합니다. 인수가 끝나면 즉시 물을 제거하고 문화 상자를 다시 성장 챔버로 옮기. 마이크로기계식 촬영 어포멀 메리스템 의 경우, 방금 시연된 바와 같이 피질 미세투벌 조직의 사전 절제 영상 스택을 획득하고 문화 상자에서 물을 문화 요리로 분리합니다.
해부 현미경으로 촬영 apical 메리스템을 옮기고, 천천히 깨끗한 0.4 x 20 밀리미터 주사기 바늘로 촬영 에 대한 정압 메리스템에 접근했다. 촬영 의 돔 주변과 바늘 끝과 접촉하여 절제가 완료되었는지 확인합니다. 그리고 멸균 된 분물로 문화 접시를 다시 채웁니다.
그런 다음 프로피듐 요오드의 밀리리터 당 10 마이크로그램을 접시에 넣고 6시간 동안 2시간마다 시연된 이미지 스택을 즉시 획득하여 배양 접시를 각 시간 지점 사이의 배양으로 되돌리게 합니다. 데이터 분석을 위해 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 이미지 스택의 표면 프로젝션을 생성하고 피지의 피브릴 툴 매크로를 사용하여 피질 미세 투튜블 이소트로피추출을 수행합니다. 여기서, 소우주 결합 도메인 GFP 라인에서 얻은 전형적인 프로젝션 이미지는 분리된 피질 마이크로투블러를 포함하는 돔의 중심에 세포가 있고, 주변의 세포, 피질 마이크로튜브를 포함하는 경계 도메인 세포가 세포의 긴 축과 평행하게 정렬되는 것을 관찰할 수 있다.
시간 경과 이미징은 고도로 무질서한 어레이에서 절제 후 6시간 이내에 보다 조직된 배열로 변화하는 피질 마이크로투룰 정렬을 보여줍니다. 텐서는 피질 미세 투덜르 이미지에 중첩 될 수 있으며, 추출 된 정보는 시간이 지남에 따라 평균 이소트로피를 플로팅하여 나타낼 수 있습니다. 레이저 출력 전력 및 게인 설정을 조정할 때, 우리는 필라멘트의 명확한 관찰을 보장하고 과포화 신호가 나중에 분석에서 인장 방향을 편향 할 수 있기 때문에 과다 노출을 피하려고노력해야합니다.
원자력 현미경 검사는 또한 기계력의 변화가 실제로 세포벽의 물리적 상태에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위하여 수행될 수 있습니다.
