Bu protokol, mezenkimal hücrelerin veya tümör invazyonunun birikme alanları gibi intratümör heterojenitesinin diferansiyel mRNA ekspresyonunu analiz etmek için lazer mikrodisseksi ve RNA dizilimi kullanır. Bu yöntem kaliteli doku histolojisi ve RNA bütünlüğünü korumak için yüksek kaliteli lazer mikrodiskes örneklerinin elde kolaylaştırmak için optimize edilmiştir. Bu yöntem hassas ve son derece tekrarlanabilir.
Çeşitli tümör modellerinde tümör morfolojisi ve heterojenitesini incelemek için kullanılabilir. Dondurulmuş beyin tümör dokusunun lazer mikrodizması, tümör dokularından hücre popülasyonlarının ayrık anatomik alanlarının moleküler profillerini incelemek için izole edilmesi için uygun maliyetli ve güvenilir bir tekniktir. LMD tümör ilerlemesi sırasında meydana gelen moleküler olaylar hakkında derinlemesine mekanik bilgi kazanmak için kullanılabilir, ve yeni terapötik hedefleri ortaya çıkarabilir.
Fare tümörü yükünün in vivo biyolüminesansı bir sinyale 10 ile 10 arasında altı ile 10 arasında 7. Karaciğer ve akciğerler tamamen kan temizlenmiş olana kadar ötenazi tümör taşıyan farenin dolaşım sistemi aracılığıyla flush oksijenli tyrode çözeltisi. Daha 15 dakika boyunca tyrode çözeltisi içinde çözünmüş% 30 sakaroz çözeltisi ile hayvan perfüzyon devam edin.
Perfüzyonun başarısını değerlendirmek için, boyun, kuyruk ve bacakların sirkülasyon sonunda sert olduğunu doğrulayın. Sonra standart protokollere göre beyin hasat ve taze% 30 sakaroz çözeltisi gecede beyin saklamak. Kriyopreservation hazırlanmak için, soğuk isopentane-2-metilbütan ile bir kavanoz doldurun ve sıvı nitrojen dolu bir kap içine kavanoz yerleştirin.
Çözücü soğurken, beyni bir filtre kağıdının üzerine kurutun ve beyni etiketli bir Cryomold'a yerleştirin. Cryomold merkezine optimum sıcaklık kesme orta yaklaşık beş mililitre dikkatle ve istenilen yönde kalıp içine beyin yerleştirin. Temiz forsepskullanarak, cryomold'u hızlı bir şekilde soğutulmuş isopentane-2-methylbutane'ye 30 ila 40 saniye süreyle yerleştirin.
Kesme ortamı katıladıktan sonra, Cryomold'ı kuru buza aktarın ve Cryomold'u sarın ve dondurulmuş beyin dokusunu eksi 80 santigrat derece depolama için alüminyum folyoya sarın. Dondurulmuş beyin tümörü doku bölümleri elde etmek için, ilk eksi 20 ve eksi 24 santigrat derece arasında bir kriyostat sıcaklığı ayarlayın ve 30 ila 60 dakika için kriyostat odasına örnek blok yerleştirin. Numune dengelenirken, oda ve bıçak tutucuyu %100 etanol ile temizleyin ve kesit fırçalarını RNase temizleme solüsyonuyla püskürtün.
Numune hazır olduğunda, kalıbı çıkarın ve dondurulmuş doku bloğunu kriyostat numune diskine takmak için taze kesme ortamı kullanın. Bloğu disk tutucuya yerleştirin ve bloğu bıçak bıçağıyla hizala. Doku parçalarını kesme yüzeyine dikkatlice düzleştirmek ve çıkarmak için Rnase içermeyen fırçalardan birini kullanarak beynin 10 mikrometrelik bölümlerini edinin.
Beyin dokusu bölümlerini slaytların üzerine monte etmek için, etiketli RNase içermeyen PEN cam kaydırağının pozitif yüklü tarafına düzgün bir şekilde bastırın ve kaydırağı odanın içindeki bir saklama kutusuna yerleştirin. Tüm slaytlar toplandığında, depolama kutusunu eksi 80 dereceye yerleştirin. Lazer mikro diseksiyondan önce kesme ortamını eritmek için, slaytları 30 saniyelik sıralı alçalan etanol daldırmalarında batırın ve ardından kristal mor çözeltisi %0,5 eozin Y çözeltisinde 20 saniye ve beş saniye boyunca boyanın.
Eozin Y kuluçka sonunda, slaytlar kuru engellemek ve sırayla artan etanol daldırma slaytlar dehydrate için filtre kağıdı kullanın. 60 saniyelik etanol daldırma sonra, üç dakika ksilen bir kapta slaytlar durulayın. Daha sonra, rnase içermeyen su ile hazırlanan montaj ortamıörnekleri montaj önce oda sıcaklığında 10 saniye boyunca RNase içermeyen yüzeyüzerinde slaytlar kuru.
10 ila 20 saniye sonra slaytları mikroskop mikrodisesise platformuna aktarın. Lazer yakalama mikrodisseksiiçin, lazer açmadan önce gücü açın. Ardından, bilgisayardaki mikroskop denetleyicisini açın ve lazer yakalama mikrodiseksiyon yazılımını başlatın.
Mikroskop Kontrol panelinde, 10 kat büyütme yi seçin. Lazer Kontrol altında, doku diseksiyonu için lazer parametrelerini ayarlayın ve 120 hertz lazer frekansı ve doğru lazer mikrodisseksi için% 100 lazer akımı seçin, 10 hızı ayarlayın ve diyafram ayarlamak 10 mikrometre. O zaman gücü 53'e ayarla.
Bölümü takip eden dokuyu yakalayacak doku kollektörüne yükleyin ve ikinci Boşalt düğmesini tıklatın. Boş kolektörü, tüp başına 30 mikrolitre lysis tamponu içeren DNase ve Rnase içermeyen 0,5 mililitre PCR düz baş tüpleri ile değiştirin. Toplayıcıyı makineye döndürün ve devam edin'i tıklatın.
İşlenmiş numuneyi mikroskoba yükleyin ve lazer mikrodiseksiyon yazılımında Boşalt'ı tıklatın. Örneği slayt tutucuya yerleştirin ve slayt tutucuyu sahneye yerleştirin. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın ve Şekilleri Kes penceresinde Kes'i Çiz'i seçin.
İlgi alanını bulmak ve ilgi alanı etrafında bir anahat çizmek için mikroskop kontrollerini kullanın. Sonra bir hedef kollektör tüp seçin ve doku mikrodisseksi devam etmek için Başlat Cut tıklayın. Tüm ilgi alanları incelendiğinde, kolektör tüplerini tutucudan aşağı işlenene kadar kuru buza aktarın.
Üstün morfolojisi ve RNA bütünlüğü olan dokuların elde edilmesi için çeşitli perfüzyon yaklaşımları değerlendirildi. İlgi alanlarını incelemek için, RNA için zararsız boyalar ile dokuları lekelemek için gereklidir. Daha sonra timon solüsyonu ve %30 sakaroz içeren tümör taşıyan farelerin perfüzyonu ve ardından %30 sakarozda bir gecede kuluçka makinesi fare dokusunun morfolojisi ve RNA bütünlüğünün korunmasına neden olarak sonuçlanır.
Paraformaldehit doku fiksasyonu yüksek kaliteli doku morfolojisi ile sonuçlansa da RNA bütünlüğü olumsuz etkilenir. Tyrode solüsyonu veya tiroit çözeltisi ve %30 sakaroz solüsyonu kuluçkaları gibi diğer yaklaşımlar RNA kalitesini etkilemez, ancak doku morfolojisinde azalmış bir çözünürlük gözlenir. Dokular montaj ortamı ile monte edilmezse, kesitler susuz kalır ve morfoloji bozulurken, doku örneklerinin %15 montaj ortamı ile suda çözünmüş yüksek kaliteli doku morfolojisi korunur.
Lazer yakalama mikrodisze mikroskop görüntüleme diseksiyon için tümör dokusunun seçimi sağlar. Bu ilgi alanı seçimi, RNA bütünlük analizi için her doku numunesi içinde ilgi alanlarının diseksiyonuna olanak tanır. Yüksek kaliteli tümör doku morfolojisi ve RNA bütünlüğünün korunması çok önemlidir.
Tyrode solüsyonu ve %30 sakarozda gece muhafazası ile %30 sakaroz perfüzyonu LMD için doku morfolojisini önemli ölçüde geliştirir. Gan çözeltisi ile hızlı bir şekilde fiksasyon, boyama ve montaj, RNA kalitesinin korunması ve doku içinde çatlakların oluşmasını önlemek için kritik bir adımdır. Hem RNA kalite kontrolü hem de transkripsiyonanalizi için uygun miktarda RNA elde etmek için doku alanı başına 6.mikrometre toplam tümöre en az 2.5 kat 10 kesit lemenizi öneririz.
LMD, preklinik glioma modellerinde gelecekteki çevirisel gelişim için yeni potansiyel hedefleri ortaya çıkarabilecek glioma heterojenitesini ve invazyonunu düzenleyen moleküler sinyal yollarının analizini sağlar.
