Este protocolo utiliza microdissecção a laser e sequenciamento de RNA para analisar a expressão diferencial mRNA da heterogeneidade intratumor, como áreas de acúmulo de células mesenquimais ou áreas de invasão tumoral. Este método foi otimizado para preservar a histologia tecidual de boa qualidade e a integridade do RNA para facilitar a aquisição de amostras de microdisseção a laser de alta qualidade. Este método é sensível e altamente reprodutível.
Pode ser utilizado para estudar morfologia tumoral e heterogeneidade em vários modelos tumorais. A microdisseção a laser do tecido tumoral cerebral congelado é uma técnica econômica e confiável para o isolamento de áreas anatômicas discretas de populações celulares de tecidos tumorais para estudar seus perfis moleculares. A LMD pode ser utilizada para obter conhecimento mecanicista aprofundado sobre os eventos moleculares que ocorrem durante a progressão do tumor, e pode revelar novos alvos terapêuticos.
Uma bioluminescência in vivo da carga tumoral do camundongo atinge um sinal entre uma vez 10 a seis e uma vezes 10 para o 7º fótons. Flush solução de tirana oxigenada através do sistema circulatório do rato portador de tumor eutanizado até que o fígado e pulmões tenham sido completamente limpos de sangue. Continue perfundando o animal com solução de 30% de sacarose dissolvida em solução de tyrode por mais 15 minutos.
Para avaliar o sucesso da perfusão, confirme que o pescoço, cauda e pernas são rígidos no final da circulação. Em seguida, colher o cérebro de acordo com os protocolos padrão e armazenar o cérebro durante a noite em solução fresca de 30% de sacarose. Para se preparar para a criopreservação, encha um frasco com isopentane fria-2-metilbutano e coloque o frasco em um recipiente cheio de nitrogênio líquido.
Enquanto o solvente está esfriando, borre o cérebro seco em um pedaço de papel filtro e coloque o cérebro em um Cryomold rotulado. Cuidadosamente em aproximadamente cinco mililitros de temperatura ideal cortando médio para o centro do Cryomold e colocar o cérebro no molde na orientação desejada. Usando fórceps limpos, coloque rapidamente o Cryomold na isopentane-2-metilbutano refrigerado por 30 a 40 segundos.
Uma vez que o meio de corte tenha se solidificado, transfira o Cryomold para gelo seco e enrole o tecido cerebral congelado cryomold e encaixe tecido cerebral congelado em papel alumínio para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para adquirir seções congeladas de tecido tumoral cerebral, primeiro defina a temperatura de um criostat entre menos 20 e menos 24 graus Celsius, e coloque o bloco amostral na câmara criostat por 30 a 60 minutos. Enquanto a amostra estiver equilibrando, limpe a câmara e o porta-faca com 100% de etanol e pulverize os pincéis da seção com solução de limpeza RNase.
Quando a amostra estiver pronta, remova o molde e use meio de corte fresco para anexar o bloco de tecido congelado ao disco de espécime do criostat. Coloque o bloco no suporte do disco e alinhe o bloco com a lâmina da faca. Adquira 10 seções de micrômetros do cérebro usando um dos pincéis livres de Rnase para achatar cuidadosamente e desenrolar os pedaços de tecido na superfície de corte.
Para montar as seções de tecido cerebral nas lâminas, pressione suavemente o lado carregado positivamente de um deslizamento de vidro PEN sem RNase rotulado sobre a seção e coloque o slide em uma caixa de armazenamento dentro da câmara. Quando todos os slides tiverem sido coletados, coloque a caixa de armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para dissolver o meio de corte antes da micro dissecção a laser, submergir os slides em imersões sequenciais de etanol descendente de 30 segundos seguidas por coloração de solução violeta cristalina por 20 segundos e cinco segundos em solução 0,5% eosina Y.
No final da incubação eosin Y, use papel filtro para bloquear os slides secos e desidratar os slides em imersões sequenciais ascendentes de etanol. Após a imersão de etanol de 60 segundos, enxágue os slides em um recipiente de xileno por três minutos. Em seguida, seque as lâminas na superfície livre de RNase à temperatura ambiente por 10 segundos antes de montar as amostras em meio de montagem preparado com água livre de RNase.
Após 10 a 20 segundos, transfira os slides para a plataforma de microdisseção do microscópio. Para microdisseção de captura a laser, ligue a energia antes de ligar o laser. Em seguida, ligue o controlador de microscópio no computador e inicie o software de microdisseção de captura a laser.
No painel Controle do Microscópio, selecione a ampliação de 10 vezes. Sob controle a laser, defina os parâmetros laser para dissecção tecidual e selecione uma frequência laser de 120 hertz e uma corrente laser de 100% Para microdisseção a laser precisa, defina a velocidade para 10 e defina a abertura para 10 micrômetros. Em seguida, afina a energia para 53.
Carregue o coletor de tecido que capturará o tecido após a seção e clique no segundo botão Descarregar. Substitua o coletor vazio por tubos de cabeça plana PCR de 0,5 mililitros sem Dase e sem rnase contendo 30 microliters de tampão de lise por tubo. Devolva o coletor para a máquina e clique para continuar.
Carregue a amostra processada no microscópio e clique em Descarregar no software de microdisseção a laser. Suba a amostra no suporte de slides e coloque o suporte de slides no palco. Clique em Continuar e selecione Cortar o corte na janela Formas de Corte.
Use os controles de microscópio para encontrar a área de interesse e desenhar um contorno em torno da região de interesse. Em seguida, selecione um tubo coletor de destino e clique em Iniciar corte para prosseguir a microdisseção do tecido. Quando todas as áreas de interesse forem dissecadas, transfira os tubos coletores do suporte para o gelo seco até que estejam em processamento a jusante.
Para adquirir tecidos com morfologia superior e integridade do RNA, foram avaliadas várias abordagens de perfusão. Para dissecar as áreas de interesse, é necessário manchar os tecidos com corantes inócuos para RNA. A perfusão subsequente de camundongos portadores de tumor com solução de tyrode e 30% de sacarose seguida de uma incubação durante a noite em 30% de sacarose resulta na preservação da morfologia e integridade do RNA do tecido do camundongo.
Embora a fixação do tecido paraformaldeído resulte em uma morfologia tecidual de alta qualidade, a integridade do RNA é impactada negativamente. Outras abordagens como o uso de uma incubação de solução de tyrode, ou solução de tyrode mais incubações de solução de sacarose de 30% não afetam a qualidade do RNA, mas observa-se uma resolução reduzida na morfologia tecidual. Se os tecidos não forem montados com meio de montagem, as seções ficam desidratadas e a morfologia se deteriora enquanto a montagem das amostras de tecido com 15% de montagem média dissolvida na água mantém uma morfologia tecidual de alta qualidade.
A imagem do microscópio de microdisseção de captura a laser permite a seleção do tecido tumoral para dissecção. Essa região de seleção de interesse permite, então, dissecção de áreas de interesse dentro de cada amostra de tecido para análise de integridade do RNA. Manter uma morfologia de tecido tumoral de alta qualidade e integridade do RNA é fundamental.
A solução de tyrode e a perfusão de 30% de sacarose com preservação durante a noite em 30% de sacarose melhora significativamente a morfologia tecidual para LMD. A fixação rápida de lyoma, coloração e montagem com solução DE GAN é um passo fundamental para preservar a qualidade do RNA e evitar que as rachaduras se formem dentro do tecido. Recomendamos seccionar pelo menos 2,5 vezes 10 para o 6º tumor total de micrômetros quadrados por área de tecido para obter quantidades apropriadas de RNA para controle de qualidade de RNA e análise transcriômica.
A LMD permite a análise das vias de sinalização molecular que regulam a heterogeneidade e a invasão do glioma que poderiam revelar novos alvos potenciais para o desenvolvimento translacional futuro em modelos de glioma pré-clínico.
