이 프로토콜은 레이저 미세 절과 RNA 염기를 사용하여 중간 엽 세포의 축적 영역 또는 종양 침입 영역과 같은 종양 이질성의 차등 mRNA 발현을 분석합니다. 이 방법은 고품질 의 레이저 미세 절시 샘플의 수집을 용이하게하기 위해 양질의 조직 조직 조직 및 RNA 무결성을 보존하도록 최적화되었습니다. 이 방법은 민감하고 재현성이 높습니다.
그것은 다양한 종양 모델에서 종양 형태학 및 이질성을 연구하기 위해 활용할 수 있다. 냉동 뇌종양 조직의 레이저 미세 절제는 종양 조직에서 세포 집단의 이산 해부학 영역을 분리하여 분자 프로파일을 연구하는 비용 효과적이고 신뢰할 수 있는 기술입니다. LMD는 종양 진행 중에 일어나는 분자 사건에 대한 심층적인 기계론적 지식을 얻기 위해 활용될 수 있으며 새로운 치료 목표를 드러낼 수 있습니다.
마우스 종양 부담의 생체 내 생물 발광은 7 광자 에서 10~10~10회 사이의 신호에 도달한다. 간과 폐가 완전히 혈액을 지울 때까지 안락사 종양 베어링 마우스의 순환 시스템을 통해 산소 로동 액액을 플러시합니다. 15분 동안 티로드 용액에 용해된 30% 자당 용액으로 동물을 계속 인내합니다.
관류의 성공을 평가하기 위해, 목, 꼬리 및 다리가 순환의 끝에 경직되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 뇌를 수확하고 신선한 30 % 자당 용액에 밤새 뇌를 저장합니다. 냉동 보존을 준비하기 위해, 감기 isopentane-2-메틸 부탄으로 항아리를 채우고 액체 질소로 채워진 용기에 항아리를 놓습니다.
용매가 차가운 동안, 필터 종이에 뇌를 건조하고 라벨 크라이오폴드에 뇌를 배치합니다. 크릴로몰드의 중심으로 중간을 절단하는 최적의 온도의 약 5 밀리리터에서 조심스럽게 원하는 방향으로 금형에 뇌를 배치합니다. 깨끗한 집게를 사용하여, 신속하게 30 ~ 40 초 동안 차가운 isopentane-2-메틸 부탄에 크라이오폴드를 배치합니다.
절단 매체가 고화되면, 드라이 아이스에 크라이오폴드를 전송하고 냉동 뇌 조직을 알루미늄 호일에 감싸고 영하 80도 저장합니다. 냉동 뇌종양 조직 섹션을 취득하려면 먼저 영하 20도에서 영하 24도 사이의 저온을 설정하고 샘플 블록을 30~60분 동안 저온챔버에 배치합니다. 샘플이 평형화되는 동안 챔버와 칼 홀더를 100% 에탄올로 청소하고 RNase 클리닝 용액으로 단면 브러시를 분사하십시오.
시료가 준비되면 금형을 제거하고 냉동 조직 블록을 냉동 조직 블록에 부착하여 냉동 절단 매체를 사용하여 냉동 된 시편 디스크에 부착하십시오. 블록을 디스크 홀더에 놓고 블록을 칼날과 정렬합니다. Rnase 가 없는 브러시 중 하나를 사용하여 뇌의 10 마이크로미터 섹션을 획득하여 조직 조각을 절삭 표면에 조심스럽게 평평하게 하고 말리게 합니다.
슬라이드에 뇌 조직 섹션을 장착하려면 라벨이 부착된 RNase 가 없는 PEN 유리 슬라이드의 양전하 측을 부드럽게 눌러 섹션에 슬라이드를 놓습니다. 모든 슬라이드가 수집되면 저장 상자를 섭씨 영하 80도에 놓습니다. 레이저 마이크로 해부 전에 절단 매체를 용해하려면 슬라이드를 30초 순차적 내림차순 에탄올 몰입으로 담그고 0.5%eosin Y 용액으로 20초 5초 동안 염색합니다.
eosin Y 인큐베이션의 끝에서 필터 용지를 사용하여 슬라이드를 건조하게 차단하고 순차적으로 오름차순 에탄올 몰입으로 슬라이드를 탈수합니다. 60초 에탄올침이 뚫린 후, 슬라이드를 자일렌 용기에 넣고 3분간 헹구십시오. 다음으로, RNase가 없는 물로 제조된 마운팅 매체에 샘플을 장착하기 전에 실온에서 RNase가 없는 표면의 슬라이드를 10초 동안 건조시하십시오.
10~20초 후에 슬라이드를 현미경 현미경 마이크로 디스섹션 플랫폼으로 옮기십시오. 레이저 캡처 마이크로 절의 경우 레이저를 켜기 전에 전원을 켭니다. 다음으로, 컴퓨터의 현미경 컨트롤러를 켜고 레이저 캡처 마이크로 절제 소프트웨어를 시작합니다.
현미경 제어판에서 10배 배율을 선택합니다. 레이저 제어하에 조직 해부에 대한 레이저 매개 변수를 설정하고 120 헤르츠의 레이저 주파수와 100 %의 레이저 전류를 선택하면 정확한 레이저 미세 절에 대해 속도를 10으로 설정하고 조리개를 10 마이크로 미터로 설정합니다. 그런 다음 전원을 53으로 설정합니다.
단면 다음 조직을 캡처하는 조직 수집기와 두 번째 언로드 버튼을 클릭하는 조직 수집기로드합니다. 빈 컬렉터를 튜브당 30마이크로리터의 용액 버퍼를 포함하는 DNase 및 Rnase 가 없는 0.5 밀리리터 PCR 플랫헤드 튜브로 교체하십시오. 수집기를 컴퓨터에 반환하고 계속 진행하려면 클릭합니다.
처리된 시편을 현미경에 로드하고 레이저 미세 절제 소프트웨어에서 언로드를 클릭합니다. 샘플을 슬라이드 홀더에 올려 놓고 슬라이드 홀더를 스테이지에 배치합니다. 계속 클릭하여 잘라낸 셰이프 창에서 그리기 컷을 선택합니다.
현미경 제어를 사용하여 관심 영역을 찾고 관심 영역 주위에 윤곽을 그립니다. 그런 다음 대상 수집관을 선택하고 시작 컷을 클릭하여 조직 미세 절을 진행합니다. 관심 있는 모든 영역이 해부되면 수집가 튜브를 홀더에서 드라이 아이스로 옮겨 다운스트림 처리가 될 때까지 옮습니다.
우수한 형태학 및 RNA 무결성을 가진 조직을 취득하기 위하여는, 각종 관류 접근이 평가되었습니다. 관심 영역을 해부하려면 RNA에 대한 무해한 염료로 조직을 얼룩지게해야합니다. 티로드 용액과 30%의 자당과 종양 베어링 마우스의 후속 관류는 30%의 자당에서 하룻밤 배양에 이어 마우스 조직의 형태 및 RNA 무결성의 보존을 초래한다.
파라포름알데히드 조직 고정은 고품질 조직 형태학을 초래하지만 RNA 무결성은 부정적인 영향을 미칩니다. 티로드 용액 인큐베이션, 또는 티로드 용액 플러스 30% 자당 용액 인큐베이션을 사용하는 것과 같은 다른 접근법은 RNA 품질에 영향을 미치지 않지만 조직 형태에 대한 분해능이 감소되는 것으로 관찰된다. 조직이 장착 매체로 장착되지 않으면, 단면도가 탈수되고 물에 용해된 15%의 장착 배지를 가진 조직 견본의 장착하는 동안 형태학이 악화되는 것은 고품질 조직 형태를 유지합니다.
레이저 포획 미세 절 현미경 이미징은 해부를 위한 종양 조직의 선택을 허용합니다. 관심 선택의 이 지역은 RNA 무결성 분석을 위한 각 조직 견본 내의 관심 있는 지역의 해부를 허용합니다. 고품질 종양 조직 형태와 RNA 무결성을 유지하는 것은 매우 중요합니다.
30%의 자당에서 하룻밤 보존을 가진 타이로드 용액과 30%의 자당 관류는 LMD에 대한 조직 형태를 크게 향상시킵니다. GAN 용액으로 빠른 lyoma 고정, 염색 및 장착은 RNA 품질을 보존하고 조직 내에서 균열이 형성되는 것을 방지하는 중요한 단계입니다. RNA 품질 관리 및 전사 분석 모두에 적합한 양의 RNA를 얻기 위해 조직 영역당 6제곱마이크로미터 의 총 종양으로 최소 2.5배 10배 이상 을 배분하는 것이 좋습니다.
LMD는 전임상 신경교종 모형에 있는 미래 번역 발달을 위한 새로운 잠재적인 표적을 드러낼 수 있던 신경교종 이질성 및 침략을 통제하는 분자 신호 통로의 분석을 가능하게 합니다.
