Este protocolo utiliza la microdisección láser y la secuenciación de ARN para analizar la expresión diferencial de ARNm de la heterogeneidad intratumoral, como áreas de acumulación de células mesenquimales o áreas de invasión tumoral. Este método se ha optimizado para preservar la histología tisular de buena calidad y la integridad del ARN para facilitar la adquisición de muestras de microdisección láser de alta calidad. Este método es sensible y altamente reproducible.
Se puede utilizar para estudiar la morfología tumoral y la heterogeneidad en varios modelos tumorales. La microdisección láser del tejido tumoral cerebral congelado es una técnica rentable y confiable para el aislamiento de áreas anatómicas discretas de las poblaciones celulares de los tejidos tumorales para estudiar sus perfiles moleculares. LMD se puede utilizar para obtener un conocimiento mecánico profundo sobre los eventos moleculares que tienen lugar durante la progresión tumoral, y podría revelar nuevas dianas terapéuticas.
Una bioluminiscencia in vivo de la carga tumoral del ratón alcanza una señal entre una por 10 y una por 10 a la 7a fotones. Enjuague la solución de tiradró oxigenado a través del sistema circulatorio del ratón con tumor eutanizado hasta que el hígado y los pulmones hayan sido completamente despejados de sangre. Continúe perfundiendo al animal con una solución de sacarosa al 30% disuelta en solución de tiranos durante 15 minutos adicionales.
Para evaluar el éxito de la perfusión, confirme que el cuello, la cola y las patas son rígidos al final de la circulación. Luego cosecha el cerebro de acuerdo con los protocolos estándar y almacenar el cerebro durante la noche en solución fresca de 30%sacarosa. Para preparar la criopreservación, llene un frasco con isopentano frío-2-metilbutano y coloque el frasco en un recipiente lleno de nitrógeno líquido.
Mientras el disolvente se enfría, seque el cerebro en un pedazo de papel de filtro y coloque el cerebro en una Cryomold etiquetada. Cuidadosamente a unos cinco mililitros de medio de corte de temperatura óptimo al centro de la Cryomold y coloque el cerebro en el molde en la orientación deseada. Usando fórceps limpios, coloque rápidamente el Cryomold en el isopentano refrigerado-2-metilbutano durante 30 a 40 segundos.
Una vez que el medio de corte se haya solidificado, transfiera el Cryomold al hielo seco y envuelva el tejido cerebral Cryomold y a presión en papel de aluminio para un almacenamiento de menos 80 grados Centígrados. Para adquirir secciones de tejido tumoral cerebral congelado, primero establezca la temperatura de un criostato entre menos 20 y menos 24 grados Celsius, y coloque el bloque de muestra en la cámara de criostato durante 30 a 60 minutos. Mientras la muestra se está equilibrando, limpie la cámara y el portacuchillas con 100% de etanol y rocíe los cepillos de sección con la solución de limpieza RNase.
Cuando la muestra esté lista, retire el molde y utilice un medio de corte fresco para unir el bloque de tejido congelado al disco de muestra del criostato. Coloque el bloque en el soporte del disco y alinee el bloque con la cuchilla. Adquiera secciones de 10 micrómetros del cerebro usando uno de los cepillos libres de arnés para aplanar cuidadosamente y desenroscer las piezas de tejido en la superficie de corte.
Para montar las secciones del tejido cerebral en las diapositivas, presione suavemente el lado cargado positivamente de una diapositiva de vidrio PEN sin RNase etiquetada sobre la sección y coloque la diapositiva en una caja de almacenamiento dentro de la cámara. Cuando se hayan recogido todas las diapositivas, coloque la caja de almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Para disolver el medio de corte antes de la microseección láser, sumerja los portaobjetos en inmersiones secuenciales de etanol descendente de 30 segundos seguidas de tinción de solución violeta cristalina durante 20 segundos y cinco segundos en una solución de 0,5% de eosina Y.
Al final de la incubación de eosin Y, utilice papel de filtro para bloquear los portaobjetos en seco y deshidratar los portaobjetos en inmersiones secuenciales ascendentes de etanol. Después de la inmersión en etanol de 60 segundos, enjuague los portaobjetos en un recipiente de xileno durante tres minutos. A continuación, seque los portaobjetos en la superficie libre de RNase a temperatura ambiente durante 10 segundos antes de montar las muestras en un medio de montaje preparado con agua libre de RNase.
Después de 10 a 20 segundos, transfiera las diapositivas a la plataforma de microdisección del microscopio. Para la microdisección de captura láser, encienda la alimentación antes de encender el láser. A continuación, encienda el controlador del microscopio en el ordenador e inicie el software de microdisección de captura láser.
En el panel Control del microscopio, seleccione la ampliación 10 veces. En Control láser, establezca los parámetros del láser para la disección de tejidos y seleccione una frecuencia láser de 120 hercios y una corriente láser del 100% Para una microdisección láser precisa, establezca la velocidad en 10 y ajuste la apertura a 10 micrómetros. A continuación, ajuste la alimentación a 53.
Cargue el colector de tejido que capturará el tejido después de la sección y haga clic en el segundo botón Descargar. Sustituya el colector vacío por tubos de cabeza plana PCR de 0,5 mililitros libres de DNase y Rnase que contengan 30 microlitros de tampón de lelisis por tubo. Devuelva el colector a la máquina y haga clic en continuar para continuar.
Cargue la muestra procesada en el microscopio y haga clic en Descargar en el software de microdisección láser. Suba la muestra sobre el portaobjetos y coloque el portaobjetos en el escenario. Haga clic en Continuar para continuar y seleccione Dibujar corte en la ventana Formas de corte.
Utilice los controles del microscopio para encontrar el área de interés y dibujar un esquema alrededor de la región de interés. A continuación, seleccione un tubo colector de destino y haga clic en Iniciar corte para continuar con la microdisección de tejido. Cuando todas las áreas de interés hayan sido diseccionadas, transfiera los tubos colectores del soporte al hielo seco hasta que estén en el procesamiento aguas abajo.
Para adquirir tejidos con una morfología superior e integridad del ARN, se evaluaron varios enfoques de perfusión. Para diseccionar las áreas de interés, es necesario manchar los tejidos con tintes inocuos para el ARN. La posterior perfusión de ratones portadores de tumores con solución de tirante y 30%sacarosa seguida de una incubación durante la noche en 30%sacarosa da como resultado la preservación de la morfología y la integridad del ARN del tejido del ratón.
Aunque la fijación del tejido de paraformaldehído da como resultado una morfología tisular de alta calidad, la integridad del ARN se ve afectada negativamente. Otros enfoques como el uso de una incubación de la solución tyrode, o la solución de tyrode más 30%incubación de la solución de sacarosa no afectan la calidad del ARN, pero se observa una resolución reducida en la morfología tisular. Si los tejidos no se montan con medio de montaje, las secciones se deshidratan y la morfología se deteriora mientras que el montaje de las muestras de tejido con un 15% de montaje medio disuelto en agua mantiene una morfología tisular de alta calidad.
Las imágenes del microscopio de microdisección de captura láser permiten la selección del tejido tumoral para la disección. Esta región de selección de interés permite entonces la disección de áreas de interés dentro de cada muestra de tejido para el análisis de integridad del ARN. Mantener una morfología del tejido tumoral de alta calidad y la integridad del ARN es fundamental.
La solución de Tyrode y la perfusión de sacarosa al 30% con conservación durante la noche en 30% de sacarosa mejoran significativamente la morfología tisular para la LMD. La fijación rápida del lyoma, la tinción y el montaje con la solución GAN son pasos críticos para preservar la calidad del ARN y evitar que se formen grietas dentro del tejido. Recomendamos secciones de al menos 2,5 veces 10 a los micrómetros cuadrados totales del tumor por área tisular para obtener cantidades adecuadas de ARN para el control de calidad del ARN y el análisis transcriptómico.
LMD permite el análisis de las vías de señalización molecular que regulan la heterogeneidad y la invasión del glioma, lo que podría revelar nuevos objetivos potenciales para el desarrollo traslacional futuro en modelos de glioma preclínico.
