Dieses Protokoll verwendet Laser-Mikrodissektion und RNA-Sequenzierung, um die differenzielle mRNA-Expression der Intratumorheterogenität zu analysieren, wie z. B. Bereiche der Akkumulation von mesenchymalen Zellen oder Bereiche der Tumorinvasion. Diese Methode wurde optimiert, um hochwertige Gewebehistologie und RNA-Integrität zu erhalten, um die Erfassung von hochwertigen Lasermikrosektionsproben zu erleichtern. Diese Methode ist empfindlich und sehr reproduzierbar.
Es kann verwendet werden, um Tumormorphologie und Heterogenität in verschiedenen Tumormodellen zu studieren. Die Lasermikrodissektion von gefrorenem Hirntumorgewebe ist eine kostengünstige, zuverlässige Technik zur Isolierung diskreter anatomischer Bereiche von Zellpopulationen aus Tumorgeweben, um ihre molekularen Profile zu untersuchen. LMD kann genutzt werden, um tiefgehendes mechanistisches Wissen über die molekularen Ereignisse zu gewinnen, die während der Tumorprogression stattfinden, und könnte neue therapeutische Ziele offenbaren.
Eine In-vivo-Biolumineszenz der Maustumorbelastung erreicht ein Signal zwischen einem mal 10 bis sechs und einmal 10 bis 7. Photonen. Spülen Sie sauerstoffreiche Tyrode-Lösung durch das Kreislaufsystem der eingeschläferten tumortragenden Maus, bis Leber und Lunge vollständig von Blut befreit sind. Setzen Sie das Tier mit 30%Saccharoselösung in Tyrode-Lösung für weitere 15 Minuten gelöst durch.
Um den Erfolg der Perfusion zu bewerten, bestätigen Sie, dass Hals, Schwanz und Beine am Ende des Kreislaufs starr sind. Dann ernten Sie das Gehirn nach Standardprotokollen und speichern Sie das Gehirn über Nacht in einer frischen 30%Saccharose-Lösung. Um sich auf die Kryokonservierung vorzubereiten, füllen Sie ein Glas mit kaltem Isopentan-2-Methylbutan und legen Sie das Glas in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff gefüllt.
Während das Lösungsmittel kühlt, bleben Sie das Gehirn auf einem Stück Filterpapier trocken und legen Sie das Gehirn in einen markierten Cryomold. Bei etwa fünf Millilitern optimaler Temperaturschnittmedium bis zur Mitte des Cryomolds vorsichtig und das Gehirn in die Form in der gewünschten Ausrichtung legen. Mit sauberen Zangen den Cryomold schnell 30 bis 40 Sekunden in das gekühlte Isopentan-2-Methylbutan geben.
Sobald das Schneidmedium erstarrt ist, übertragen Sie den Cryomold auf Trockeneis und wickeln Sie den Cryomold und schnappen Sie gefrorenes Hirngewebe in Aluminiumfolie für minus 80 Grad Celsius Speicher. Um gefrorene Hirntumorgewebeabschnitte zu erhalten, stellen Sie zunächst die Temperatur eines Kryostats zwischen minus 20 und minus 24 Grad Celsius ein und legen Sie den Probenblock für 30 bis 60 Minuten in die Kryostatkammer. Während die Probe ausgeglichen ist, reinigen Sie den Kammer- und Messerhalter mit 100% Ethanol und sprühen Sie die Schnittbürsten mit RNase Reinigungslösung.
Wenn die Probe fertig ist, entfernen Sie die Form und verwenden Sie frisches Schneidmedium, um den gefrorenen Gewebeblock an der Probenscheibe des Kryostats zu befestigen. Legen Sie den Block in den Scheibenhalter und richten Sie ihn an der Messerklinge aus. Erwerben Sie 10 Mikrometer Abschnitte des Gehirns mit einer der Rnase-freien Bürsten, um die Gewebeteile vorsichtig abzuflachen und auf die Schnittfläche zu entwirn.
Um die Hirngewebeabschnitte auf die Dias zu montieren, drücken Sie die positiv geladene Seite einer beschrifteten RNase-freien PEN-Glasrutsche problemlos auf den Abschnitt und legen Sie die Rutsche in eine Aufbewahrungsbox innerhalb der Kammer. Wenn alle Dias gesammelt sind, legen Sie die Aufbewahrungsbox bei minus 80 Grad Celsius. Um das Schneidmedium vor der Lasermikrosektion aufzulösen, tauchen Sie die Dias in 30-Sekunden-Sequenzabsenkungen in Ethanol ein, gefolgt von kristallvioletter Lösungsfärbung für 20 Sekunden und fünf Sekunden in 0,5%eosin Y-Lösung.
Verwenden Sie am Ende der Eosin-Y-Inkubation Filterpapier, um die Dias zu blockieren, die in sequenziellen aufsteigenden Ethanol-Eintauchen trocknen und dehydrieren. Nach dem 60-Sekunden-Ethanol-Eintauchen die Dias in einem Behälter mit Xylol für drei Minuten abspülen. Als nächstes trocknen Sie die Dias auf RNase-freier Oberfläche bei Raumtemperatur für 10 Sekunden, bevor Sie die Proben in Montagemedium mit RNase-freiem Wasser aufbereiten.
Übertragen Sie die Dias nach 10 bis 20 Sekunden auf die Mikroskop-Mikrodissektionsplattform. Schalten Sie die Stromversorgung ein, bevor Sie den Laser einschalten, um die Mikrosektion zu erfassen. Schalten Sie als Nächstes den Mikroskop-Controller im Computer ein und starten Sie die Laser-Capture-Mikrodissektionssoftware.
Wählen Sie im Bedienfeld "Mikroskop" die 10-fache Vergrößerung aus. Legen Sie unter Lasersteuerung die Laserparameter für die Gewebesektion fest und wählen Sie eine Laserfrequenz von 120 Hertz und einen Laserstrom von 100%Für eine genaue Lasermikrosektion, stellen Sie die Geschwindigkeit auf 10 und die Blende auf 10 Mikrometer ein. Stellen Sie dann die Leistung auf 53 ein.
Laden Sie den Gewebekollektor, der das Gewebe nach dem Abschnitt erfasst, und klicken Sie auf die zweite Schaltfläche Entladen. Ersetzen Sie den leeren Kollektor durch DNase und Rnase-freie 0,5 Milliliter PCR-Flachkopfrohre, die 30 Mikroliter Lysepuffer pro Tube enthalten. Geben Sie den Kollektor an die Maschine zurück, und klicken Sie auf Fortfahren, um fortzufahren.
Laden Sie die verarbeitete Probe auf das Mikroskop und klicken Sie in der Laser-Mikrodissektionssoftware auf Entladen. Die Probe auf den Schiebehalter aufsteigen und den Schiebehalter auf die Bühne stellen. Klicken Sie auf Weiter, um fortzufahren, und wählen Sie Im Fenster Schnittformen ausschneiden aus.
Verwenden Sie die Mikroskopsteuerung, um den Interessenbereich zu finden und einen Überblick über die Interessenregion zu zeichnen. Wählen Sie dann ein Zielkollektorrohr aus und klicken Sie auf Schnitt starten, um die Gewebemikrodissektion fortzusetzen. Wenn alle Interessengebiete seziert sind, übertragen Sie die Kollektorrohre vom Halter auf Trockeneis, bis sie nachgelagert werden.
Um Gewebe mit einer überlegenen Morphologie und RNA-Integrität zu erfassen, wurden verschiedene Perfusionsansätze evaluiert. Um die Interessensgebiete zu sezieren, ist es notwendig, das Gewebe mit harmlosen Farbstoffen für rna zu färben. Die anschließende Perfusion tumortragender Mäuse mit Tyrodelösung und 30%Saccharose gefolgt von einer nächtlichen Inkubation in 30%Saccharose führt zur Erhaltung der Morphologie und RNA-Integrität des Mausgewebes.
Obwohl die Paraformaldehydgewebefixierung zu einer qualitativ hochwertigen Gewebemorphologie führt, wird die RNA-Integrität negativ beeinflusst. Andere Ansätze wie die Verwendung einer Tyrode-Lösungsinkubation oder eine Tyrodenlösung plus 30%Saccharose-Lösungsinkubationen beeinflussen die RNA-Qualität nicht, aber es wird eine reduzierte Auflösung in der Gewebemorphologie beobachtet. Wenn die Gewebe nicht mit Montagemedium montiert sind, werden die Abschnitte dehydriert und die Morphologie verschlechtert sich, während die Montage der Gewebeproben mit 15%Montagemedium in Wasser gelöst eine hochwertige Gewebemorphologie aufrechterhält.
Lasercapture Mikrodissektion smikroskopische Bildgebung ermöglicht die Auswahl des Tumorgewebes für die Zerlegung. Diese Interessensbereich-Auswahl ermöglicht dann die Zerlegung von Interessengebieten innerhalb jeder Gewebeprobe für die RNA-Integritätsanalyse. Die Aufrechterhaltung einer hochwertigen Tumorgewebemorphologie und RNA-Integrität ist entscheidend.
Tyrode-Lösung und 30%Saccharose-Perfusion mit über Nacht Konservierung in 30%Saccharose verbessert signifikant Gewebemorphologie für LMD. Die schnelle Lyomafixierung, Färbung und Montage mit GAN-Lösung ist ein entscheidender Schritt, um die RNA-Qualität zu erhalten und Risse im Gewebe zu verhindern. Wir empfehlen, mindestens 2,5-mal 10 bis zum 6. Quadratmikrometer Gesamttumor pro Gewebebereich zu sektionieren, um angemessene MENGEN an RNA sowohl für die RNA-Qualitätskontrolle als auch für die transkriptomische Analyse zu erhalten.
LMD ermöglicht die Analyse der molekularen Signalwege, die die Heterogenität und Invasion von Gliom regulieren und neue potenzielle Ziele für die zukünftige translationale Entwicklung in präklinischen Gliommodellen aufzeigen könnten.
