הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה

xenograft שמקורו בדגי זברה הוא מודל פרה-קליני רב עוצמה לחיזוי פרופיל הרגישות הכימותרפית של חולי סרטן in vivo. הפרוטוקול מתאר את יצירת המודל החל מדגימה כירורגית של מטופל. על ידי השתלת מקטע רקמה קטן במקום לבודד תאים לעוברים של דגי זברה, ניתן לשמור על המיקרו-סביבה של הגידול שהיא השלב המכריע להתקדמות הגידול ולתגובה לכימותרפיה.

היתרון הגדול של המודל טמון בפוטנציאל שלו לחזות את הפרוגנוזה של המטופל במסגרת זמן קלינית רלוונטית של שבוע אחד בלבד המשמש ככלי לרפואה מותאמת אישית. התחל את עיבוד הדגימה על ידי שטיפת רקמת הגידול כולה שנאספה מהמטופל עם חמישה מיליליטר של מדיום גידול טרי. פיפטה אותו למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק.

יש לשאוף בזהירות ולהשליך את אמצעי הכביסה לפני שחוזרים על הכביסה שלוש פעמים. לטבול את הדגימה אחד עד שני מיליליטר של מדיום הגידול הטרי. חותכים את דגימת הגידול לחתיכות קובייה של מילימטר עד שניים באמצעות להב אזמל, ולאחר מכן מניחים אותם בצינור פלסטיק סטרילי של חמישה מיליליטר עם תווך גידול.

לאחר הגדרת מסוק רקמות McIlwain לעובי 100 מיקרומטר, מניחים את חתיכות הגידול על שולחן הפלסטיק העגול של המסוק וקוצצים אותם. סובבו את השולחן ב-90 מעלות וחזרו על החיתוך. אספו את שברי הגידול הקצוצים בצינור פלסטיק של 15 מיליליטר המכיל את תווך הגידול.

צנטריפוגו את שברי הגידול הקצוצים ב 300 גרם במשך שלוש דקות לפני שואפים ומשליכים את supernatant. לדגור על השברים עם תמיסת עקבות התא או עם מעקב תאים פלואורסצנטי חלופי כגון CM-DiI או אדום עמוק במשך 30 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. במהלך הדגירה, בעדינות להשעות מחדש את השברים כל 10 דקות.

בסיום הצביעה, יש להסיר כל צבע חופשי על ידי הוספת מדיום גידול בתוספת לפחות 1% חלבון. הנפח יהיה פי חמישה מנפח הצביעה. צנטריפוגו את השברים ב-300 גרם למשך שלוש דקות והשליכו את הסופרנטנט.

הוסיפו מיליליטר אחד של מלח חוצץ פוספט או DPBS של Dulbecco וחזרו על שלב השטיפה שלוש פעמים. לאחר שתסיים, תשהה את השברים בחמישה מיליליטר של DPBS בצלחת פטרי 60 מ"מ. כדי לבסס את הקסנוגרפטים או zPDX המבוססים על דגי זברה, יש להרדים את העוברים יומיים לאחר ההפריה.

בצלחת פטרי בעלת שלושה גלילי אגרוז, הניחו עובר דג זברה על גליל החושף צד אחד. הסר את התמיסה העודפת כדי לשמור על העובר בסרט דק. בעזרת מלקחיים סטריליים, מעבירים את פיסת שברי רקמת הגידול המוכתמת מצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ לתמיכה של 1% אגרוז שבה מניחים את העובר.

לאחר מכן להרים את הרקמה ולהניח אותו על חלמון העובר לפני דחיפתו לתוך החלל perivitelline באמצעות מיקרו-מחט זכוכית משוך חום. הוסף כמה טיפות של E3 1% פניצילין סטרפטומיצין לעובר כדי להחזיר אותו לתוך הנוזל. לאחר חזרה על השתלת רקמת הגידול בכל העוברים, יש להסיר את תמיכות האגרוז מצלחת הפטרי ולדגור על העוברים בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס.

שעתיים לאחר ההשתלה, בדוק את העוברים עבור xenografts הנכון עם כתמים חיוביים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. יש להשליך את העוברים המתים ואת העוברים ללא שברי הגידול לחלוטין בתוך החלל הפריביטלי. לאחר שסיימו, חלקו באופן אקראי את העוברים בשש צלחות מרובות בארות, המחולקות באופן שווה לקבוצות על פי תוכנית הניסוי.

לדלל את התרופות על ידי ערבוב אותם לתוך E3 1% pen-strep כדי להכין את קוקטייל FOLFOXIRI. לאחר שעתיים של השתלה, להסיר את המדיה מכל באר ולהוסיף את קוקטייל התרופה. הכניסו את העוברים לאינקובטור בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים עם שינויים יומיים של המדיום כדי לחדש את התרופות.

להדמיה, צלם תמונות תחת מטרה של 40X של המיקרוסקופ הקונפוקלי. השתמש ברזולוציה של 1024 על 512 פיקסלים עם מרווח Z של חמישה מיקרומטרים. כל תמונות ההר של zPDXs שנרכשו כדי לנתח את האפופטוזיס שזוהה בציאנו הראו כי הטיפול המשולב הגביר את אפופטוזיס התא בהשוואה לקבוצת הביקורת.

מחקר המקרה דיווח כי זוהתה עלייה מובהקת סטטיסטית בשבר התאים האפופטוטיים בקסנוגרפטים מושתלים בקבוצה שטופלה ב- FOLFOXIRI בהשוואה לקבוצת הביקורת. הפרוטוקול מציג דוגמה באמצעות רקמת סרטן הלבלב, אך ניתן לקבוע קסנוגרפטים שמקורם בדגי זברה מסוגים שונים של סרטן. בנוסף, מכיוון שלמודל יש השפעה אתית נמוכה, הוא ניתן לניצול בקלות לסינון in vivo של תרופות חדשות.

השיטה מאתגרת מבחינה טכנית ודורשת מפעיל מומחה. מומחיות קודמת במניפולציה של עוברים בדגי זברה ובמיקרו-הזרקה תאיץ את אימון הטכניקה.