באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לטפח פרוסות רקמה של החדר השמאלי האנושי ex vivo בתא ביומימטי. היישום של עומסים לפני ואחרי משפר את הדמיון של הסביבה הפיזיולוגית. טכניקה זו מאפשרת רישום רציף של התכווצות רקמות.
פרוטוקולי גירוי המוגדרים על-ידי המשתמש מאפשרים הערכה של פרמטרי כיווץ חיוניים כמו פוטנציה לאחר הפסקה, סף גירוי, יחס כוח-תדר ותקופה עקשן. הטיפוח ארוך הטווח של פרוסות שריר הלב, באמצעות מערך זה, יסלול את הדרך למחקר ex vivo עתידי, ויקל על הקרנה זו להשפעות תרופתיות טיפוליות וקרדיוטוקסיות ברפואת הלב וכלי הדם. כדי להתחיל, להטביע את תאי הטיפוח ואלקטרודות הגרפיט לליטר אחד של תמיסת איזופרופנול של 10% ולהתסיס בן לילה.
למחרת, מעבירים את התאים לתמיסת איזופרופנול של 100% למשך 3 דקות, ואז מאפשרים לתאים ולאלקטרודות הגרפיט להתייבש באוויר מתחת למכסה זרימה למינרי. חבר לוח מעגלים לכל תא בהתאם למיקומים הזמינים על הנדנדה. מניחים שתי אלקטרודות גרפיט על לוח המעגלים בהתאם להוראות היצרן, ואז מניחים מכסה צלחת פטרי באורך 35 מילימטרים על התא כדי למנוע זיהום.
לאחר מכן, מלאו את מגש החיתוך עד 90 עד 95% עם מאגר חיתוך. מעבירים את דגימת הרקמה לצלחת פטרי באורך 100 מילימטרים במילוי חיץ קר, ומניחים את המנה על צלחת קירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את הטרבקולה אנדוקרדיאלית על ידי החזקת אנדוקרדיום בפינצטה, ולאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך כ -3 מילימטרים של רקמת אנדוקרדיאל.
קבעו את דגימת הרקמה החתוכה, הצד האנדוקרדיאלי עד לתיקון גומי בגודל 2 על 2 ס"מ באמצעות ארבע מחטים בגודל 0.9 על 70 מילימטר 20 מילימטרים המקובעות במצב מרובע. ודאו שהקצה האלכסוני של כל קצה מחט מצביע פנימה, משפר את הקיבוע ומונע נזק לשריר הלב. באמצעות אזמל, חותכים את כל הרקמה העודפת מחוץ לארבעת ריבועי המחט.
באמצעות פינצטה, מניחים את הדגימה הגזומה על פיסת רקמה סטרילית למשך 10 שניות כדי להסיר עודפי חיתוך. לאחר מכן, הסר את מזרק האגרוז מאמבט המים והטביע את הדגימה באגרוס. תנו לאגרוזה להתמצק במשך חמש דקות על צלחת קירור.
הצד האנדוקרדיאלי של המדגם חייב להיות גלוי באגרוז. באמצעות פינצטה, מניחים את הצד האפיקרדיאלי של הדגימה הכלולה באגרוז על גבי האזור המודבק, ואז לוחצים בעדינות על הדגימה המכילה אגרוז מלמעלה עם כלי קהה מבלי לחתוך או לפגוע באגרוז. תנו לדבק להתמצק למשך דקה אחת.
הגדר את משרעת הרטט ל-1 מילימטר, את מהירות החיתוך הראשונית ל-0.07 מילימטר לשנייה ואת עובי הפרוסה ל-300 מיקרון. לאחר חיבור מערכת הטיפוח למחשב, הפעל את התוכנה המתאימה. הגדר את מהירות הנדנדה ל-60 סל"ד והגדר מראש את פרמטרי הגירוי.
עבור פרוסות לב אנושיות, הגדר את הגירוי הסטנדרטי לדחפים דו-פאזיים עם 50 מילימפ או זרם המורכב מזרם חיובי של 3 אלפיות השנייה, הפסקה של אלפית השנייה ופולס של 3 אלפיות השנייה של זרם הפוך בקצב קצב של 30 פעימות לדקה או bpm, ולאחר מכן בדוק את מחווני האלקטרודה של התוכנה וודא שהאלקטרודות של תאי הטיפוח פועלות כראוי. באמצעות פינצטה, להפריד את האגרוז מן הרקמה. הימנעו מלגעת ברקמה וטפלו בה בזהירות, שכן כל פגיעה ברקמה תפחית את אחוזי ההצלחה של הטיפוח.
כדי לחבר שני משולשי פלסטיק לדגימה, הניחו מיקרוליטר אחד של דבק על מכסה צלחת פטרי סטרילי. השתמשו בפינצטה מחוברת כדי להרים משולש פלסטיק אוטומטי אחד. טבלו במהירות את הקצה הקדמי של המשולש בדבק והדביקו את המשולש על הדגימה בניצב ליישור הקרדיומיוציטים.
חזור על הפעולה עבור המשולש השני. בעזרת אזמל, חותכים את הרקמה העולה על רוחב המשולש ומניחים את הפרוסה עם שני המשולשים המותקנים בחזרה למגש החיתוך המכיל מאגר חיתוך. הסר את תא הטיפוח המלא הבינוני מהחממה.
בחר פרוסה אחת מוכנה והכנס אותה לתא על-ידי חיבור משולש אחד לכל סיכה. התאם את המרחק בין פיני ההרכבה לגודל המדגם. ודא שהמדגם שקוע בתווך.
לאחר הנחת המנה על הנדנדה, הקטן את הטעינה מראש על ידי סיבוב בורג הכוונון נגד כיוון השעון עד שבסיס הגרף המתאים על מסך המחשב אינו משתנה עוד, ולאחר מכן הגדל בזהירות את הטעינה מראש או המתח על ידי סיבוב בורג הכוונון בכיוון השעון. עבור תאים עם קשיחות גבוהה, המשך עד שקו הבסיס המתאים בגרף גדל ב- 1, 000 ל- 1, 200 יחידות המתאימות לטעינה מראש של מילינווטון אחד. לאחר הכנת מדיום הטיפוח הטרי, מחממים מראש את המדיום באמבט מים או באינקובטור אוויר חם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 45 דקות.
מוציאים את המדיום מהתא, ומשאירים כ-0.8 מיליליטרים בתא, ואז מוסיפים 1.6 מיליליטרים של מדיום טרי לאותו תא, מה שהופך את הנפח הכולל של בינוני ל-2.4 מיליליטרים לכל תא. לבסוף, הניחו את הכיסוי של החדר בחזרה והניחו את תא הטיפוח במקומו המתאים. הקריאה של כיווץ חמש פרוסות שריר הלב במהלך גירוי טיפוסי כללה ארבעה חלקים נפרדים של פוטנציה לאחר ההשהיה, סף הגירוי, יחס כוח-תדר ותקופת עקשן.
בהשוואה לשליטה, כוח הכיווץ של הפרוסות שטופלו באנטגוניסטים של סידן, ניפדיפין וקלציצפטין, פחת תוך 10 דקות. לעומת זאת, אגוניסט תעלת הסידן המגודר במתח, Bay-K8644, הגדיל את כוח ההתכווצות. הפוטנציה לאחר ההפסקה של פרוסות הבקרה והפרוסות המטופלות הוערכה עבור שחרור הסידן התוך-תאי מהרשתית הסרקופלסמית.
פרוסת הבקרה לא הראתה שינויים כלשהם. בנוכחות קלציצפטין וניפדיפין, עיכוב תעלות הסידן מסוג L הוביל לפוטנציה של ההתכווצות הראשונה לאחר הפסקה של 50 שניות, המשקפת תרומה יחסית גבוהה יותר של שחרור סידן תוך תאי להתכווצות מוחלטת. ההשפעה ההפוכה נצפתה עם Bay-K8644, אשר מגרה את כניסתו של סידן חוץ-תאי דרך תעלות הסידן מסוג L.
בניתוח יחסי כוח-תדר, לא נצפה שינוי בפרוסת הבקרה. הטיפול בקלציצפטין לא שינה את יכולתה של הפרוסה לעקוב אחר הגירויים עם עליית תדירות הגירוי בעת השוואת הנתונים לפני ואחרי הטיפול. בהשוואה לקלציצפטין, ניפדיפין מנע עלייה בהתכווצות בשיעורי קצב גבוהים יותר והפחית את קצב הלכידה המרבי ב-80 פעימות לדקה.
עם Bay-K8644 נצפה כוח כיווץ מוגבר בתדרי גירוי נמוכים מאוד. עם זאת, בתדרים הגבוהים מ-50 פעימות לדקה, כוח ההתכווצות היה נמוך יותר מאשר במצב שלפני הטיפול. יש להעביר במהירות רקמה שנכרתה ל-4 מעלות קרדיופלגיה.
לאחר החיתוך, משולשי פלסטיק חייבים להיות מחוברים בניצב לכיוון הסיבים. הטעינה מראש לא תעלה על 1500 מילינווטון. תרבית פרוסות ביומימטית יכולה לסייע לחוקרים להשתמש במניפולציות גנטיות, כמו גם בטיפולים מבוססי תאים לחקר התחדשות ותיקון בשריר הלב האנושי הבוגר.
