Name: preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses
Uploaded: 2020-05-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
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이 연구는 보조금 F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) 및 K23DC014517 (존슨, PI) 청각 장애및 건강의 국립 연구소의 다른 통신 장애에 대한 국립 연구소에서 지원되었다.

이 연구는 뉴욕 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 따라 수행되었습니다.
1. 해부 쥐 후두
<ol><li>제도적으로 승인된 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시합니다. 하악에서 마누브리움으로 복부 목을 면도하고 술로 면봉하여 조직 표본의 모피 오염을 방지합니다.</li>
	<li>10배배율을 가진 해부 범위에서 기관체가 노출될 때까지 메스로 중간선 목 절개를 만들어 후두 전체를 소비한다.</li>
	<li>중간선에서 복부 외두 근육을 분리하여 포셉을 사용하여 후두를 노출하고 가위 또는 메스를 해부합니다.</li>
	<li>기관가 를 제3 기관 고리로 분리하고 해부 가위를 사용하여 전체 후두를 소비하기 위해 효이드 뼈에 절개 로스트랄을 만듭니다.</li>
	<li>배율하에서 미세 절도구(핀셋, 핀, 미세시)를 사용하여 후두에서 외두 조직(식도, 갑상선 및 외두 근육)을 제거합니다.</li>
	<li>미세 한 부와 함께, 후위 cricotenoid 근육 사이 중간 라인을 사용 하 여 아리티노이드 사이 후두를 이중으로. 후두의 측면 벽을 핀으로 표시하여 보컬 주름을 노출한 다음 갑상선 연골의 중간선을 통해 미세 시저로 보컬 주름의 전방 분리(도 1)를 통해 양분하게 선회한다. 참고: 이 단계는 선택 사항일 수 있습니다. 후두전체를 유지하기 위해 건너뛸 수 있습니다. 후두의 양절은 동일한 후두의 오른쪽과 왼쪽을 별도로 사용하여 다중 면역 염색 기술을 허용합니다.</li>
	<li>인산완충액(PBS)에서 각각 헤미후두를 헹구고, 동결 시 얼음 결정 형성을 줄이기 위해 작업 와이퍼로 섬세하게 건조시킵니다.</li>
</ol>2. 후두 조직을 수정 및/또는 플래시 동결
참고: 고정은 모든 면역 염색 프로토콜에 적합하지 않을 수 있습니다. 종종 후두 조직은 해부 직후 에새로 얼어 붙습니다. 단계 2.1을 건너뛰고 후두 조직을 고정하지 않고 플래시 동결시합니다.
<ol><li>헤미 후두를 해결하기 위해 70 rpm의 궤도 셰이커에서 실온에서 1 시간 동안 PBS에서 4 % 포름 알데히드로 채워진 원심 분리기 튜브에 조직을 배치합니다. 깨끗한 원심분리기 튜브로 조직을 옮기고 PBS에서 20분 동안 3배 헹구십시오. 그런 다음 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮기고 4°C에서 20% 자당/5% 글리세롤 용액(~18h 또는 조직이 가라앉을 때까지)에 침수한다. 주의: 포름알데히드는 위험하며 적절한 개인 보호 장비와 함께 연기 후드에 사용해야합니다.</li>
	<li>모든 헤미 후두를 균일한 위치에 배치하여 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물로 채워진 냉동 금형에 넣습니다. hemilarynx의 경우, 극저온의 바닥을 향한 보컬 폴드의 내측 표면과 극저온 개구부의 하부 가장자리에 평행하게 보컬 접힌의 세로 측면을 가진 조직을 배치한다. 전체 후두의 경우, 극저온의 바닥을 향한 후방 리코리테노이드와 극저온 개구부의 하부 가장자리에 평행하게 보컬 접힌 종방향 측면을 가진 조직을 놓습니다. 참고: OCT 화합물 내에서 일관된 후두 방향은 쥐 보컬 폴드의 극저분균에 매우 중요합니다. 헤밀리엔스가 내장되고 얼어 붙으면 방향을 바꾸기 위해 해동하여 여러 해동 동결 주기로 인한 조직 손상의 위험을 소개해야 합니다.</li>
	<li>액체 질소로 둘러싸인 강철 비커로 냉각된 isopentane(2-메틸부탄)를 사용한 플래시 동결 조직. 참고: isopentane는 백색 침전이 비커13의 측면과 바닥에 형성하기 시작할 때 조직 동결을 위한 최적 온도에 도달합니다. 이스펜탄은 액체 질소보다 열 전도도가 높기 때문에 사용되며, 이는 급속한 동결 시 조직 블록의 균열을 방지하는 데 도움이 됩니다. OTC에서 조직을 동결에 대한 자세한 설명은 쿠마르 외.13을 참조하십시오.</li>
	<li>각 금형을 라벨이 붙은 호일로 감싸고 개별 냉동고 가방에 넣어 탈수방지하고 -80°C 냉동고에 보관할 때까지 드라이 아이스에 즉시 보관하십시오.</li>
</ol>3. 단면 평면의 극저부 헤밀리엔스
<ol><li>냉동저온을 -20°C로 설정하여 제조업체 매뉴얼에 의한 근육 조직 단면에 권장되는 온도 범위(15-25°C)의 중간에 있습니다.</li>
	<li>10 μm 두께의 섹션으로 저온 분면 두께를 설정합니다. 참고: 근육 섬유 단면 분석의 경우, 10 μm 두께의 단면은 섬유 타이핑 분석을 위한 라벨이 부착된 근육 섬유의 완전한 염색 및 견고한 이미징 강도를 허용하는 것이 최적입니다14,15,16. 일부 프로토콜신경 근육 대상에 따라 다른 단면도 두께 를 요구할 수 있습니다.</li>
	<li>극저온 챔버로 조직을 옮기고, 저온 시편 디스크(chuck)에 OCT 화합물의 균일한 층을 추가하고, 임베디드 조직 블록을 표본 디스크 위에 놓습니다. 흉선(TA) 근육 섬유 분석을 위한 보컬 접이식의 단면을 얻으려면, 척에 표본을 부착하여 복부 갑상선 연골이 극저온 블레이드를 마주하고 아리티노이드 연골이 표본 디스크에 직면하도록 한다. 참고: 동결시 OCT 화합물이 흰색과 불투명해짐에 따라 이러한 랜드마크가 이 단계에서 표시되지 않습니다. 이러한 가시성 부족은 플래시 동결 단계에서 헤밀리엔스의 방향을 주목하는 것이 중요한 이유입니다.</li>
	<li>갑상선 연골의 복부 부분이 나타날 때까지 표본 머리를 100 μm로 전진시킴으로써 OCT 화합물을 트림합니다.</li>
	<li>그런 다음 갑상선 연골발병부터 라미나 프로프리아, 내측 TA 근육 및 측면 TA 근육이 노출될 때까지 30 μm 섹션을 손질하고 추적합니다. 참고: 후두 랜드마크는 단면각도가 비스듬히 되지 않도록 100μm마다 갑상선 연골이 발병하여 추적하여 주목해야 합니다. 도 2 는 10배배율의 단면 평면에서 두 개의 후두 랜드마크 세트를 나타냅니다.</li>
	<li>대상 TA 근육에 도달하면 10 μm에서 양전하 슬라이드의 섹션을 수집합니다.</li>
	<li>PBS에 섹션을 4°C로 저장하여 염색할 준비가 될 때까지 수분을 유지합니다. 참고: 고정 된 조직은 IHC 표적에 따라 최대 1 주일까지 PBS에 저장 될 수 있지만 고정되지 않은 조직은 즉시 처리되어야합니다.</li>
</ol>4. 경도 평면의 극저부 헤밀리엔스
<ol><li>저온 챔버가 다시 -20°C로 설정되면 단면 두께를 30 μm로 변경합니다. 참고: NMJ 분석의 경우, 30-60 μm 사이의 조직 두께는 신경 단자 또는 모터 엔드플레이트11,12,17의 단편화 없이 후두 근육 내의 몇 가지 완전한 NMJ를 캡처하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>TA 근육의 NMJ 분석을 위한 세로 성보컬 접이식 부분을 얻으려면, 후면이 극저온 블레이드를 향하도록 척에 표본을 부착하고 기관 루멘은 시편 디스크쪽으로 아래로 향합니다.</li>
	<li>갑상선 연골이 나타날 때까지 표본 머리를 100 μm로 전진시켜 OCT 화합물을 다듬습니다.</li>
	<li>TA 근육의 라미나 프로프리아및 내측 및 측면 분열이 드러날 때까지 갑상선 발병으로부터 30 μm의 섹션을 손질하고 추적합니다. 참고: 세로 평면의 후두 랜드마크 5세트는 표적 TA 근육을 향한 조직 깊이 진행을 추적하는 것이 좋습니다. 도 3 은 10배배율로 세로 평면의 후두 랜드마크를 나타낸다.</li>
	<li>표적 TA 근육에 도달하면 30 μm에서 양전하 슬라이드에 대한 섹션을 수집합니다.</li>
	<li>PBS에 섹션을 4°C로 저장하여 염색할 준비가 될 때까지 수분을 유지합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

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신경 근육 분석을 위한 쥐 보컬 주름을 준비하는 것은 각종 도전으로 제시할 수 있습니다. 후두 근육은 작고 연골에 둘러싸여 있어 표적 근육을 직접 추출하기가 어려워질 뿐만 아니라 후두 해부학 적 랜드 마크의 깊이에서 동물 들 사이에서 높은 가변성을 발견했습니다. 근육의 경우, 전체 보컬 접이식 섹션은 NMJ 분석 프로토콜(표 1)에 대한 종로 평면에서 63-126 단면(섹션당 35 μm)보다...

쥐 후두는 발달, 노화, 질병 및 약리학 에이전트에 구조적이고 기능적인 신경 근육 후두 적응을 조사하는 잘 확립 된 모델입니다1,2,3,4,5. 조직학적 방법의 일관성은 후두 연골 내에서 캡슐화 된 근육의 후두 크기, 모양 및 지형과 관련된 도전뿐만 아니라 근육 준비 및 분석에 관련된 여러 가지 복잡성이 있기 때문에이 작업 라인에 중요합니다1,6,7,8,9,10,11 . 쥐 내성 후두 근육의 작은 크기로 인해 체계적인 포함, 동결 및 냉동 절개는 일관되고 정확한 결과를 달성하는 데 중요합니다. 예를 들어, 관상 평면에서 쥐 보컬 접을 분리할 때, 내래 후두 근육 4개 중 4개의 신경근육 접합부(NMJs)는 조직 깊이11의 1.8mm 미만 내에 위치한다. 따라서, 동결 절제 동안 후두 근육 해부학의 정밀한 모니터링은 정확하게 관심의 섹션을 식별하고 조직의 과부를 방지하는 것이 필수적이다. 대상 근육의 과분은 NMJs11의 수와 지형을 부정확하게 식별할 수 있거나 랜드마크 방향 혼동으로 인해 대상 근육이 버려지면 시료 크기가 전반적으로 감소될 수 있다12. 후두 근육과 각각의 적응에 대한 새로운 모델이 개발됨에 따라 연구 전반에 걸쳐 결과가 정확하고 신뢰할 수 있으며 재현가능한지 확인하는 표준 수술 절차가 필수적입니다.
이 문서의 목적은 최적의 세로 및 단면 분석을 위해 쥐 보컬 폴드의 세부 준비입니다. 우리의 실험실에서 정기적으로 사용되는 상세한 방법은 냉동 절제 동안 대상 근육 랜드 마크를 식별하기 위해 설명된다. 유사한 방법은 여러 실험실에서 사용되지만 초보 조사관이 구현할 때 신뢰할 수 있고 정확한 복제를 보장하기 위해 문헌보다 더 자세한 정보가 여기에 제공됩니다. 이 튜토리얼의 목표는 실험실 및 조사 전반에 걸쳐 일관성을 개선하기 위해 쥐 보컬 접이의 면역 조직화학 (IHC) 평가를위한 표준 방법론을 제공하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>2-Methylbutane Certified</td><td>Fisher Chemical</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Tongs SS</td><td>Thermo Scientific</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat blades</td><td>C.L. Sturkey D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Underpads</td><td>Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>Dissection kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Frozen Section Medium</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Bel-Art</td><td>11999054</td><td></td></tr><tr><td>Immunostain Moisture Chamber</td><td>Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>Needle holders</td><td>Assi</td><td>ASSI.B148</td><td></td></tr><tr><td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td><td>Quick Medical</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Storage Bags</td><td>Fisherbrand</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td><td>Polar Ware</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Task wiper</td><td>Kimberly-Clark Professional&amp;trade; 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisherbrand</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Pattern Scissors</td><td>Assi</td><td>ASSI.SAS15RV</td><td></td></tr><tr><td>NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

이 튜토리얼의 목적은 조직화학 신경 근육 연구에 대한 쥐 보컬 접기의 준비를 설명하는 것입니다. 이 프로토콜은 쥐 후두 해부, 플래시 동결 및 보컬 주름의 저온 절제에 대한 절차를 간략하게 설명합니다. 이 연구는 세로 및 단면 평면 모두에서 저온 절 보컬 주름을 하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 참신은 내성 후두 근육의 정확한 식별을 보장하고 조직 손실의 기회를 감소 극저온 절제 하는 동안 후두 추적. 수치는 두 평면에서 점진적 극저온절을 보여줍니다. 29마리의 쥐 헤미 후두는 갑상선 연골의 출현에서 전체 보컬 접이를 포함하는 첫 번째 섹션의 출현까지 극저고 를 추적했다. 전체 보컬 폴드는 두 평면의 모든 동물을 위해 시각화되었습니다. 갑상선 연골의 출현에서 두 평면에서 전체 보컬 폴드의 출현까지 의 거리에서 높은 가변성이 있었다. 무게는 후두 랜드 마크의 깊이와 상관 관계가 없었다, 개별 가변성 및 조직 준비와 관련된 다른 요인은 단면 동안 랜드 마크의 출현에 높은 가변성에 대한 책임이있을 수 있음을 시사. 이 연구는 방법론을 자세히 설명하고 조직 화학 신경 근육 조사를위한 쥐 보컬 접이를 준비하기위한 형태학적 데이터를 제시합니다. 높은 개별 가변성 때문에, 후두 랜드 마크는 조직과 조직 손실을 과분하는 것을 방지하기 위하여 극저온 절제 도중 밀접하게 추적되어야 합니다. 쥐 후두 내의 랜드 마크의 적절 한 조직 준비 및 인식을 포함 하 여 일관 된 방법론의 사용, 연구 전반에 걸쳐 일관 된 결과 지원 하 고 후두 신경 근육 메커니즘을 조사 하는 모델로 쥐 보컬 접을 사용 하 여 관심 있는 새로운 연구원을 원조.

대표적인 결과는 후두 신경 근육 시스템에 음성 운동의 효력의 지속적인 조사의 일부였습니다. 29 남성 피셔 344/갈색 노르웨이 쥐 (12 9 개월, 17 24 개월)는 CO2 흡입으로 무게와 안락사 되었다 양측 thoracotomy.
절차는 NMJs와 측면 및 내측 TA 근육의 섬유 크기를 표시하는 설명 된 프로토콜을 따랐다. 후두 랜드 마크 사이의 거리는 후두 근육과 주변 연골을 사용하여 경도 및 ?...

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Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

이 프로토콜은 조직 화학 신경 근육 연구에 대 한 쥐 보컬 주름을 준비 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.

신경 근육 분석을위한 쥐 보컬 폴드의 준비

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

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Neuroscience

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비디오: Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

연구

신경과학

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting communication abilities. 1, 2 Targeted training (speech/voice therapy) can improve specific voice deficits,3, 4 although the underlying mechanisms of behavioral interventions are not well understood. Systematic investigation of voice deficits and therapy should consider many factors that are difficult to control in humans, such as age, home environment, age post-onset of disease, severity of disease, and medications. The method presented here uses an animal model of vocalization that allows for systematic study of how underlying sensorimotor mechanisms change with targeted voice training. The ultrasonic recording and analysis procedures outlined in this protocol are applicable to any investigation of rodent ultrasonic vocalizations.
The ultrasonic vocalizations of rodents are emerging as a valuable model to investigate the neural substrates of behavior.5-8 Both rodent and human vocalizations carry semiotic value and are produced by modifying an egressive airflow with a laryngeal constriction.9, 10 Thus, rodent vocalizations may be a useful model to study voice deficits in a sensorimotor context. Further, rat models allow us to study the neurobiological underpinnings of recovery from deficits with targeted training.
To model PD we use Long-Evans rats (Charles River Laboratories International, Inc.) and induce parkinsonism by a unilateral infusion of 7 &mu;g of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle which causes moderate to severe degeneration of presynaptic striatal neurons (for details see Ciucci, 2010).11, 12 For our aging model we use the Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).
Our primary method for eliciting vocalizations is to expose sexually-experienced male rats to sexually receptive female rats. When the male becomes interested in the female, the female is removed and the male continues to vocalize. By rewarding complex vocalizations with food or water, both the number of complex vocalizations and the rate of vocalizations can be increased (Figure 1).
An ultrasonic microphone mounted above the male's home cage records the vocalizations. Recording begins after the female rat is removed to isolate the male calls. Vocalizations can be viewed in real time for training or recorded and analyzed offline. By recording and acoustically analyzing vocalizations before and after vocal training, the effects of disease and restoration of normal function with training can be assessed. This model also allows us to relate the observed behavioral (vocal) improvements to changes in the brain and neuromuscular system.

Voice disorders are debilitating in aging and Parkinson disease. The ultrasonic vocalizations of rats, also affected by these conditions, can be used to study these voice disorders, their neural substrates, and the nature of functional recovery with behavioral intervention.

세 Parkinsonian 쥐의 초음파 Vocalizations의 타겟 트레이닝

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if any, therapies exist that target age-related laryngeal muscle dysfunction. Neurotrophins are involved in muscle innervation and differentiation of neuromuscular junctions (NMJs). It is thought that neurotrophins enhance neuromuscular transmission by increasing neurotransmitter release. The neuromuscular junctions (NMJs) become smaller and less abundant in aging rat laryngeal muscles, with evidence of functional denervation. We explored the effects of NTF4 for future clinical use as a therapeutic to improve function in aging human laryngeal muscles. Here, we provide the detailed protocol for systemic application and direct injection of NTF4 to investigate the ability of aging rat laryngeal muscle to remodel in response to NTF4 application. In this method, rats either received NTF4 either systemically via osmotic pump or by direct injection through the vocal folds. Laryngeal muscles were then dissected and used for histological examination of morphology and age-related denervation.

Here, we present a protocol to describe the use of neurotrophin 4 (NTF4) systemically and directly to remodel rat aging laryngeal muscles.

삼투압 펌프 또는 직접적인 근육 주사를 이용한 피하 뉴로트로핀 4 주입으로 노화 후두 근육 강화

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

발생학

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

후 병변 호흡 신경 가소성을 연구하기 위해 자궁 경부 척수 손상의 생쥐 모델

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

의학

다층 실리콘 보컬 폴드 모델의 3D 프린팅

Manufacturing Process for Non-Adhesive Super-Soft Vocal Fold Models

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal fold models results in models with undesirable properties, such as stickiness and reproducibility issues. Those vocal fold models are prone to rapid aging, leading to poor comparability across different measurements. In this study, we propose a modification to the manufacturing process by changing the order of layering the silicone material, which leads to the production of non-sticky and highly consistent vocal fold models. We also compare a model produced using this method with a conventionally manufactured vocal fold model that is adversely affected by its sticky surface. We detail the manufacturing process and characterize the properties of the models for potential applications. The outcomes of the study demonstrate the efficacy of the modified fabrication method, highlighting the superior qualities of our non-sticky vocal fold models.&#160;The findings contribute to the development of realistic and reliable vocal fold models for research and clinical applications.

저자 스포트라이트: Advancements in the Fabrication of Synthetic Vocal Fold Models for Phonetic and Robotic Applications (음성 및 로봇 응용 프로그램을 위한 합성 성대 모델 제작의 발전)

This study demonstrates the manufacturing of non-sticky and super-soft vocal fold models by introducing a specific way to create the vocal fold layers, providing a detailed description of the manufacturing procedure, and characterizing the properties of the models.

비접착식 Super-Soft 보컬 폴드 모델의 제조 공정

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal ...

공학

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

혀의 기계적 및 점탄성 특성에 대한 생체 내 평가

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Endoscopic Approach for Studying Laryngeal Dysfunction in Rodents

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close&#45;Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to impair laryngeal function, which results in difficulty&#160;breathing (dyspnea), swallowing impairment (dysphagia), and/or voice impairment (dysphonia). Dysphagia, in particular, can lead to aspiration pneumonia and associated morbidity, recurrent hospitalization, and early mortality. Despite these serious consequences, existing treatments for laryngeal dysfunction are largely aimed at surgical and behavioral interventions that unfortunately do not typically restore normal laryngeal function, thus highlighting the urgent need for innovative solutions.
To bridge this gap, we have been developing an experimental endoscopic approach to investigate laryngeal dysfunction in murine (i.e., mouse and rat) models. However, endoscopy in rodents is quite challenging due to their small size relative to current endoscope technology, anatomical differences in the upper airway, and the necessity for anesthesia to optimally access the larynx. Here, we describe a novel transoral laryngoscopy approach that permits close-up, unobstructed video imaging of laryngeal motion in mice and rats. Critical steps in the protocol include precise anesthesia management (to prevent overdosing that abolishes swallowing and/or risks respiratory distress-related mortality) and micromanipulator control of the endoscope (for stable video recording of laryngeal motion by a single researcher for subsequent quantification).
Importantly, the protocol can be performed over time in the same animals to study the impact of various pathological conditions specifically on laryngeal function. A novel advantage of this protocol is the ability to visualize airway protection during swallowing, which is not possible in humans due to epiglottic inversion over the laryngeal inlet that obstructs the glottis from view. Rodents therefore provide a unique opportunity to specifically investigate the mechanisms of normal versus pathological laryngeal airway protection for the ultimate purpose of discovering treatments to effectively restore normal laryngeal function.

This protocol describes a serial transoral laryngoscopy approach for mice and rats that permits close-up, unobstructed video imaging of the larynx during breathing and swallowing using an optimized anesthetic regimen and finely tuned endoscopic manipulation techniques.

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to ...

신경 근육 분석을위한 쥐 보컬 폴드의 준비

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후 병변 호흡 신경 가소성을 연구하기 위해 자궁 경부 척수 손상의 생쥐 모델

비접착식 Super-Soft 보컬 폴드 모델의 제조 공정

비접착식 Super-Soft 보컬 폴드 모델의 제조 공정

비접착식 Super-Soft 보컬 폴드 모델의 제조 공정

혀의 기계적 및 점탄성 특성에 대한 생체 내 평가

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close-Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing