מודל ex vivo הוא שיטה שימושית להערכת ההשפעה של התערבויות פיזיולוגיות שונות ותרכובות פרמקולוגיות וספיגת גלוקוז בשרירים. טכניקה זו מאפשרת הערכה מדויקת של ספיגת גלוקוז בשרירי שלד עכברים מבודדים בהיעדר גורמים מבלבלים שעלולים להפריע למודל של בעלי חיים שלמים. לפני תחילת הניסוי, הפעילו את מערכת הביוגרפיה של רצועת השרירים המשולבת וחממו את התאים ל-30 מעלות צלזיוס.
פתח את תוכנת איסוף הנתונים וכייל את המתמרים הכפויים כדי להבטיח יכולת השוואה בין מערכי נתונים. מוסיפים ארבעה מיליליטרים של מדיום דגירה בסיסי של 30 מעלות צלזיוס שחומם מראש לכל תא דגירה ומוודאים שהתווך מחומצן באופן רציף עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני. מניחים את העכבר במצב נוטה על מגש דיסקציה ומאשרים חוסר תגובה לרפלקס הדוושה.
לאחר מכן הצמידו כף קדמית אחת עם מחט. השתמש במספריים כדי להסיר את העור מהרגל התחתונה עד שגם גיד האכילס וגם מפרק הברך נראים לעין. לצורך כריתה של שריר הסולאוס, חברו לולאת תפר אחת בקוטר 0.4 ס"מ שהוכנה מחתיכת תפר ניילון כירורגית בלתי נספגת באורך 16 ס"מ לגיד האכילס והגיד האכילס באופן דיסטלי לגיד האכילס באופן דיסטלי ללולאה.
חותכים כדי לשחרר את שרירי הסולאוס והגסטרוקנמיוס מהכף ומחליקים בזהירות את מלקחיים הפין על פני העכבר כדי לחשוף את שריר הסולאוס. הצמידו את מלקחי הפין והניחו לולאת תפר שנייה סביב הגיד הפרוקסימלי של שריר הסולאוס. חותכים את הגיד הפרוקסימלי ומנתחים את הסולאוס כולל שתי לולאות התפר המחוברות ללא שריר הגסטרוקנמיוס.
בעת האיסוף, השתמש בלולאות כדי לחבר במהירות את שריר הסולאוס לקרסים המתאימים באחד מתאי הדגירה. השתמשו במלקחיים כדי להסיר את החיתולית המכסה את השריר הקדמי של טיביאליס. הגידים הדיסטליים של שרירי הטיביאליים הקדמיים או ה-EDL צריכים להיות לבנים בהירים, גלויים ומופרדים זה מזה.
חותכים את גיד הזיקוק של השריר הקדמי של הטיביאליס ומנתחים את השריר. השתמשו במלקחיים כדי לשחרר בעדינות את שריר ה-EDL מהרקמות הסובבות אותו, ולהשאיר את השריר שלם מבלי לחתוך את הגידים. הניחו לולאות תפר בודדות סביב הזיקוק וגידי ה-EDL הפרוקסימליים.
כאשר הלולאות הונחו, חתכו את הגידים כדי לשחרר את שריר ה-EDL עם לולאות התפרים המחוברות והצמידו במהירות את הלולאות לקרסים בתא הדגירה השני. לאחר מכן התאימו את מתח המנוחה של כל שריר לכ-5 מילינווטון ואפשרו לשרירים להתיישב בתווך במשך 10 דקות לפחות לפני תחילת הניסוי. כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז המעוררת באינסולין, החליפו את מדיום הדגירה הבסיסית בתאים במדיום הדגירה ללא אינסולין, בריכוז אינסולין תת-מקסימלי יעיל, או בריכוז אינסולין יעיל ביותר למשך 20 דקות דגירה.
בסוף תקופת הגירוי, החליפו את מדיום הדגירה במדיום ספיגת גלוקוז המכיל ריכוז זהה של אינסולין למשך 10 דקות דגירה. בסוף הדגירה של ספיגת הגלוקוז, הסירו בזהירות את השרירים מתאי הדגירה ושטפו את הדגימות במדיום דגירה בסיסי קר כקרח. לאחר הכביסה, לייבש במהירות את השרירים על נייר מסנן ולהקפיא את הרקמה ללא לולאות התפר בחנקן נוזלי.
לאחר מכן אספו 100 מיקרוליטרים של מדיום הדגירה של ספיגת הגלוקוז מכל תא לאחסון של 20 מעלות צלזיוס ולניתוח ספיגת גלוקוז בשרירים. כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז המעוררת כיווץ, מניחים אלקטרודות פלטינה במרכז ובשני צידי השרירים בתוך תאי הדגירה, ומתחילים התכווצות שרירים מיד לאחר החלפת מדיום הדגירה הבסיסית במדיום ספיגת הגלוקוז. תעד את ההפקה הכפויה מכל שריר דגירה.
לאחר 10 דקות, אספו והקפיאו בעדינות את השרירים כפי שהוכח, תוך אחסון 100 אליקוטים של מיקרוליטר של מדיום הדגירה לספיגת גלוקוז מכל תא לניתוח ספיגת גלוקוז בשרירים כפי שהודגם. כדי לקבוע את האיתות המיוצלולרי על ידי ניתוח כתמים מערבי באותה קבוצה של דגימות שרירים, הומוגניזציה של כל דגימת שריר קפואה ב-400 מיקרוליטרים של מאגר הומוגניזציה קר כקרח וסובבו את קצה הדגימה מקצה לקצה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לאסוף את ה-licate על ידי צנטריפוגאליזציה ולמדוד את כמות החלבון המעניינת בתוך כל משטח דגימה על פי פרוטוקולי ניתוח הכתמים המערביים הסטנדרטיים.
כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז בכל דגימה, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של סופרנאטנט מכל דגימה ו-25 מיקרוליטרים של מדיום ספיגת גלוקוז מתאי הדגירה המתאימים כדי להפריד בקבוקונים של ספירת ספירת נוזלים המכילים שלושה מיליליטרים של נוזל סקינטילציה נוזלי לכל בקבוקון. לאחר מכן טען את הבקבוקונים על מונה נצנוץ נוזלי ומדוד רדיואקטיביות של שני דאוקסיגלוקוס ומניטול על פי הנחיות היצרן. בניתוח מייצג זה, שיעורי ספיגת הגלוקוז הבסיסיים היו דומים בין סולאוס לשרירי EDL שבודדו מנקבות עכברים.
ספיגת הגלוקוז עלתה בשרירי הסולאוס וה-EDL בתגובה לריכוזי אינסולין תת-מקסימליים ויעילים ביותר. יתר על כן, גם ספיגת הגלוקוז התת-מקסימלית וגם ספיגת הגלוקוז המקסימלית עוררה אינסולין הייתה גבוהה יותר באופן משמעותי בשריר הסולאוס. לעומת זאת, ספיגת הגלוקוז הנגרמת על ידי התכווצות הייתה גבוהה משמעותית ב-EDL בהשוואה לשריר הסולאוס.
כאן ניתן להבחין בכוח השרירים המרבי המיוצר בשרירי סולאוס ו-EDL במהלך תקופת הגירוי של 10 דקות. כצפוי, שריר ה-EDL יצר יותר כוח במהלך החלק הראשוני של תקופת הגירוי, ולאחר מכן ירידה מהירה בהמשך תקופת הגירוי. ריכוזי אינסולין תת-מקסימליים ומקסימליים גרמו לעלייה בזרחון של Akt threonine 308 ו- TBC1D4 Serine 588, בעוד שהתכווצות גרמה לעלייה בזרחון של AMPK Alpha threonine 172 ו- ACC serine 212.
לא אינסולין ולא התכווצות הובילו לשינוי בתכולת החלבון הכוללת. לפני שמנסים למדוד את ספיגת הגלוקוז בשרירי עכבר מבודדים, חיוני לתרגל ביסודיות את הניתוח של שרירי הסולאוס וה-EDL. לאחר הערכת ספיגת הגלוקוז בשרירים, ניתן להשתמש בליזאט של חלבון השריר הנותר לניתוח ביוכימי נוסף שעשוי להבהיר את השינויים שנצפו בשיעורי ספיגת הגלוקוז.
