测量小鼠分离和孵育成熟骨骼肌中胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取

离体模型是评估各种生理干预和药理学化合物以及肌肉葡萄糖摄取的影响的有用方法。该技术允许在没有可能干扰完整动物模型的混杂因素的情况下准确评估孤立的小鼠骨骼肌中的葡萄糖摄取。在开始实验之前，打开集成的肌肉带传记系统并将腔室加热到30摄氏度。

打开数据收集软件并校准强制传感器，以确保数据集之间的可比性。向每个孵育室中加入4毫升预热的30摄氏度基础培养基，并确保培养基用95%氧气和5%二氧化碳连续氧化。将鼠标置于解剖托盘上的俯卧位置，并确认对踏板反射缺乏反应。

然后用针固定一个前爪。用剪刀从小腿上取下皮肤，直到跟腱和膝关节都可见。对于皮底肌的解剖，将一个直径为0.4厘米的缝合环连接到跟腱，该缝合线由16厘米不可吸收的手术尼龙缝合线片制成，并将固定的镊子连接到袢远端的跟腱肌腱上。

切开以从爪子上释放比目鱼和腓肠肌，并小心地将镊子滑过小鼠以暴露比目鱼肌肉。固定下镊子，并在比目鱼肌近端肌腱周围放置第二个缝合环。切除近端肌腱并解剖比目骨，包括两个连接的缝合环，没有腓肠肌。

收集后，使用环将比目鱼肌快速连接到其中一个孵育室中的相应钩子上。使用镊子去除覆盖胫骨前肌的筋膜。胫骨前肌或EDL肌的远端肌腱应为透明白色，可见且彼此分开。

切除胫骨前肌的蒸馏肌腱，切除肌肉。使用镊子轻轻地将EDL肌肉从周围组织中解放出来，使肌肉完好无损，而不会切断肌腱。将单独的缝合线环在蒸馏和近端EDL肌腱周围。

放置环后，切割肌腱以释放连接缝合环的EDL肌肉，并快速将环连接到第二个孵育室中的钩子上。然后将每块肌肉的静息张力调整到大约五毫牛顿，并在开始实验之前让肌肉在培养基中平衡至少10分钟。为了测量胰岛素刺激的葡萄糖摄取，用不含胰岛素，次最大有效胰岛素浓度或最大有效胰岛素浓度的孵育培养基替换腔室中的基础孵育培养基，以进行20分钟的孵育。

在刺激期结束时，用含有相同浓度胰岛素的葡萄糖摄取培养基替换孵育培养基，以进行10分钟的孵育。在葡萄糖摄取孵育结束时，小心地从孵育室中取出肌肉，并在冰冷的基础孵育培养基中洗涤样品。洗涤后，在滤纸上快速干燥肌肉，并在液氮中冻结没有缝合环的组织。

然后从每个腔室收集100微升葡萄糖摄取培养基进行20摄氏度的储存和肌肉葡萄糖摄取分析。为了测量收缩刺激的葡萄糖摄取，将铂电极放在孵育室内肌肉的中央和两侧，并在用葡萄糖摄取孵育培养基替换基础孵育培养基后立即启动肌肉收缩。记录每个孵化肌肉的强制生产。

10分钟后，按照所示轻轻收集并冷冻肌肉，从每个腔室中储存100微升等分试样的葡萄糖摄取培养基，用于肌肉葡萄糖摄取分析，如图所示。为了在同一组肌肉样品中通过蛋白质印迹分析来确定肌细胞信号传导，在400微升冰冷的均质缓冲液中均质化每个冷冻肌肉样品，并在4摄氏度下将样品末端旋转一小时。然后通过离心收集切片液，并根据标准的蛋白质印迹分析方案测量每个样品托盘中感兴趣的蛋白质量。

为了测量每个样品中的葡萄糖摄取量，从每个样品中加入150微升上清液，从相应的孵育室中加入25微升葡萄糖摄取培养基，以分离液体闪烁计数瓶，每个小瓶含有三毫升液体闪烁液。然后将小瓶装入液体闪烁计数器上，并根据制造商的指南测量两种脱氧葡萄糖和甘露醇的放射性。在该代表性分析中，从雌性小鼠中分离出的比目鱼和EDL肌肉之间的基础葡萄糖摄取率相似。

比目鱼和EDL肌肉的葡萄糖摄取增加，以响应亚最大和最大有效胰岛素浓度。此外，在比目鱼肌中，亚最大和最大胰岛素刺激的葡萄糖摄取均显着较高。相比之下，与比目鱼肌相比，EDL中收缩诱导的葡萄糖摄取显着更高。

在这里，可以观察到在10分钟刺激期间比目鱼和EDL肌肉产生的最大肌肉力量。正如预期的那样，EDL肌肉在刺激期的初始阶段产生了更大的力，随后在刺激期后期迅速下降。亚最大和最大胰岛素浓度诱导Akt苏氨酸308和TBC1D4丝氨酸588的磷酸化增加，而收缩诱导AMPKα苏氨酸172和ACC丝氨酸212的磷酸化增加。

胰岛素和收缩都没有导致总蛋白质含量的变化。在尝试测量孤立的小鼠肌肉中的葡萄糖摄取之前，彻底练习比目鱼和EDL肌肉的解剖至关重要。在评估肌肉葡萄糖摄取后，剩余的肌肉蛋白裂解物可用于额外的生化分析，以阐明观察到的葡萄糖摄取率的变化。