생체외 모델은 다양한 생리학적 개입 및 약리학적 화합물 및 근육 글루코스 흡수의 영향을 평가하기 위한 유용한 방법이다. 이 기술은 손상되지 않은 동물 모델에서 방해 할 수있는 교란 요인이없는 격리 된 마우스 골격근에서의 포도당 흡수의 정확한 평가를 가능하게합니다. 실험을 시작하기 전에 통합 근육 스트립 생체 사진 시스템을 켜고 챔버를 섭씨 30도까지 따뜻하게하십시오.
데이터 수집 소프트웨어를 열고 강제 트랜스듀서를 보정하여 데이터 세트 간의 비교 가능성을 보장합니다. 미리 가온된 섭씨 30도 기저 배양 배지 네 밀리리터를 각 인큐베이션 챔버에 넣고 배지가 95% 산소와 5% 이산화탄소로 지속적으로 산소화되는지 확인합니다. 마우스를 해부 트레이의 경향이있는 위치에 놓고 페달 반사에 대한 반응이 부족한지 확인하십시오.
그런 다음 바늘로 앞발 하나를 고정하십시오. 가위를 사용하여 아킬레스 힘줄과 무릎 관절이 모두 보일 때까지 다리 아래에서 피부를 제거하십시오. 발바닥 근육의 해부를 위해, 16 센티미터의 비 흡수성 수술 나일론 봉합사로 준비된 단일 직경 봉합사 루프를 아킬레스 힘줄에 부착하고 아킬레스 힘줄에 원위 방향으로 핀 포셉을 고정하십시오.
발바닥과 위장관 근육을 발바닥에서 풀어 내도록 자르고 조심스럽게 쥐를 가로 질러 오줌 포셉을 밀어 발바닥 근육을 노출시킵니다. 오줌 포셉을 아래로 고정하고 발바닥 근육의 근위 힘줄 주위에 두 번째 봉합사 루프를 놓습니다. 근위 힘줄을 자르고 위장관 근육이없는 두 개의 부착 봉합사 루프를 포함하여 발바닥을 해부하십시오.
수집 할 때 루프를 사용하여 인큐베이션 챔버 중 하나의 각 후크에 발바닥 근육을 신속하게 부착하십시오. 포셉을 사용하여 경골 전방 근육을 덮고있는 근막을 제거하십시오. 경골 전방 또는 EDL 근육의 원위 힘줄은 맑은 흰색이어야하며 눈에 띄며 서로 분리되어야합니다.
경골 전방 근육의 증류 힘줄을 자르고 근육을 해부하십시오. 포셉을 사용하여 EDL 근육을 주변 조직으로부터 부드럽게 해방시켜 힘줄을 자르지 않고 근육을 그대로 둡니다. 개별 봉합사 루프를 증류 및 근위 EDL 힘줄 주위에 놓습니다.
루프가 배치되면 봉합사 루프가 부착 된 EDL 근육을 방출하기 위해 힘줄을 자르고 루프를 두 번째 인큐베이션 챔버의 후크에 빠르게 부착하십시오. 그런 다음 각 근육의 휴식 긴장을 약 다섯 밀리 뉴턴으로 조정하고 실험을 시작하기 전에 근육이 적어도 10 분 동안 배지에서 평형을 이루도록하십시오. 인슐린 자극된 글루코스 흡수를 측정하기 위해, 챔버 내의 기초 인큐베이션 배지를 인슐린이 없는 인큐베이션 배지, 서브최대로 효과적인 인슐린 농도, 또는 20분 동안 최대한으로 효과적인 인슐린 농도로 대체한다.
자극 기간이 끝날 때, 인큐베이션 배지를 10분 동안 동일한 농도의 인슐린을 함유하는 글루코스 흡수 인큐베이션 배지로 교체한다. 글루코스 흡수 인큐베이션이 끝나면 인큐베이션 챔버에서 근육을 조심스럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 기저 배양 배지에서 샘플을 세척하십시오. 세척 후 여과지에서 근육을 빠르게 건조시키고 액체 질소에서 봉합사 루프없이 조직을 동결시킵니다.
그 다음 100 마이크로리터의 글루코스 흡수 배양 배지를 각 챔버로부터 수집하여 20도 섭씨 저장 및 근육 글루코스 흡수 분석을 위해 저장한다. 수축 자극된 글루코스 흡수를 측정하기 위해, 백금 전극을 인큐베이션 챔버 내의 근육의 중앙 및 양쪽에 배치하고, 기초 인큐베이션 배지를 글루코스 흡수 인큐베이션 배지로 교체한 직후에 근육 수축을 개시한다. 각 인큐베이션된 근육으로부터의 강제 생산을 기록한다.
10분 후, 입증된 바와 같이 근육을 부드럽게 수집하고 동결시키고, 입증된 바와 같이 근육 글루코스 흡수 분석을 위해 각 챔버로부터 글루코스 흡수 인큐베이션 배지의 100 마이크로리터 분취량을 저장한다. 동일한 근육 샘플 세트에서 웨스턴 블롯팅 분석에 의한 근세포 신호전달을 결정하기 위해, 400 마이크로리터의 얼음 냉 균질화 완충액에서 각각의 동결된 근육 샘플을 균질화하고, 샘플 말단을 섭씨 4도에서 한 시간 동안 끝까지 회전시킨다. 그런 다음 원심화에 의해 라이케이트를 수집하고 표준 웨스턴 블롯 분석 프로토콜에 따라 각 샘플 팔레트 내에서 관심있는 단백질의 양을 측정합니다.
각 샘플에서 글루코스 흡수를 측정하기 위해, 각 샘플로부터 150 마이크로리터의 상청액과 상응하는 인큐베이션 챔버로부터 25 마이크로리터의 글루코스 흡수 인큐베이션 배지를 첨가하여 바이알당 3밀리리터의 액체 섬광 유체를 포함하는 액체 섬광 계수용 바이알을 분리한다. 그런 다음 바이알을 액체 섬광 계수기에 적재하고 제조업체의 지침에 따라 두 개의 데옥시 글루코스와 만니톨의 방사능을 측정하십시오. 이 대표적인 분석에서, 기저 글루코스 흡수율은 암컷 마우스로부터 분리된 발바닥과 EDL 근육 사이에서 유사하였다.
포도당 흡수는 밑바닥과 EDL 근육에서 증가하여 최하위 및 최대 효과적인 인슐린 농도에 반응합니다. 더욱이, 아극적 및 최대 인슐린 자극된 글루코스 흡수는 모두 발바닥 근육에서 유의하게 더 높았다. 대조적으로, 수축 유도된 글루코스 흡수는 발바닥 근육에 비해 EDL에서 유의하게 더 높았다.
여기서, 10분 자극 기간 동안 발바닥 및 EDL 근육에서 생성되는 최대 근력이 관찰될 수 있다. 예상한 바와 같이, EDL 근육은 자극 기간의 초기 부분 동안 더 많은 힘을 생성했고, 자극 기간 후반에 빠른 감소가 뒤따랐다. 서브맥스 및 최대 인슐린 농도는 Akt 트레오닌 308 및 TBC1D4 세린 588의 인산화의 증가를 유도한 반면, 수축은 AMPK 알파 트레오닌 172 및 ACC 세린 212의 인산화의 증가를 유도하였다.
인슐린이나 수축은 전체 단백질 함량의 변화를 가져 오지 않았습니다. 격리 된 마우스 근육에서 포도당 흡수를 측정하기 전에 발바닥과 EDL 근육의 해부를 철저히 연습하는 것이 중요합니다. 근육 글루코스 흡수의 평가에 이어서, 남아있는 근육 단백질 용해물은 글루코스 흡수율의 관찰된 변화를 해명할 수 있는 추가적인 생화학적 분석에 사용될 수 있다.
