המחקר מומן על ידי מספרי מענקים: NCI P30 CA023108 ו- NCI U54 CA151662.

תוכנית הטיפול והשימוש בבעלי חיים של דארטמות' קולג' מוכרת על ידי האגודה האמריקאית להסמכת טיפול בחיות מעבדה (iAAALAC) ועומדת בכל ההנחיות והתקנות של UDSA ו-NIH (המשרד לרווחת חיות המעבדה). כל מחקרי ה-in vivo אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בדארטמות' קולג' (IACUC). נוהל המתת חסד תואם את הנחיות AVMA לשנת 2020 להמתת חסד של בעלי חיים.
1. מכשור/תכנון המערכת
<ol><li>תכנן אנטנת AMF (סליל) מותאמת אישית להיות לולאה סגורה, תוך בחירת צורות ליצירת השדה המגנטי הרצוי. השתמש בנוסחאות השראה ומאפיינים מבחירת גנרטור כוח כדי לתכנן סלילים תואמים כדי ליצור את השדה הרצוי. השתמש בעיצובים שונים לניסויים in vitro ו- in vivo.</li>
	<li>ודא שהשראות אנטנת AMF נמצאות בטווח המקובל של גנרטור החשמל. הוסף או החסר קבלים כדי להתאים (לכוונן) את האנטנה למחולל החשמל.</li>
	<li>לניסויים במבחנה, תכננו סליל סלילי בעל 14 סיבובים, קוטר פנימי 2 ס"מ ואורך 14 ס"מ, שיכול להכיל צינורות של 1.5 מ"ל, המאפשרים טיפול במספר דגימות בו זמנית. לבודד את הסליל עם פולימר ויניל ולהשתמש מרווח פוליסטירן כדי להפריד את הסליל מן הצינורות. פירוט מפרט התכנון והשיקולים מצויים בתיק המשלים 1.</li>
	<li>עבור ניסויי in vivo, רכשו סליל סלילי לכל הגוף שנבנה בהתאמה אישית מיצרן עם מידע עיצובי קנייני. השתמש בצינורות מרובעים בקוטר 8 מ"מ (מכיוון שהם יוצרים שדה אחיד יותר בתוך הבור של הסליל), ורכז באזור הטיפול הממוקד. הפוך את הרכז 5.0 ס"מ אורך, עם סך של 5 סיבובים וכתוצאה מכך קוטר פנימי 3.6 ס"מ, קוטר חיצוני 5.2 ס"מ, ויש לו את מיקומו באזור הטיפול הממוקד. הקף את הסליל עם קליפת פוליקרבונט.</li>
	<li>השתמש בגנרטור AMF עם הספק ותדר מתכווננים, המדורגים בהספק של 10 קילוואט ומעלה כמקור החשמל. ההשראות מתאימות את מקור ההספק והאנטנות/סלילים לטווח של 0.62 עד 1.18 μHenries (μH), ומאפשרות תדרים הנעים בין 30-300 קילוהרץ. קירור הגנרטור באמצעות מים ממוחזרים באמצעות משאבת דחיפה צנטריפוגלית, לחץ מווסת עד 50 psi.</li>
	<li>קררו את הסלילים בעזרת צ'ילר בעל קיבולת קירור של 5.6 טון השואב נוזל העברת חום על בסיס אתילן גליקול ב-25% המדולל במים דרך אנטנת AMF. הגדר את הטמפרטורה של הצ'ילר כך שהאנטנה לא תחמם או תקרר את הדגימה.</li>
	<li>עבור הכלת החיה, בנה מחזיק צינורי שניתן לתלות במרכז הסליל עם מרווח אוויר של 0.5 ס"מ בין המחזיק למשטח הסליל. חברו משאבת אוויר ממוזגת מתכווננת המזרימה אוויר דרך הקליפה סביב הסליל וקבעו אותה כך שתשמור על טמפרטורת ליבה רגילה של בעלי חיים. חבר את מכונת ההרדמה למחזיק בעל החיים הצינורי ליד ראש החיה כדי להבטיח אספקה נאותה של הרדמה.</li>
	<li>להכלת תאים, צרו מנגנון שמזרים מים מאמבט מים דרך הספייסר שבו ממוקמים הצינורות. הגדר את הטמפרטורה של אמבט מים זה כך שהצינורות מוקפים במים ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>השתמש בבדיקות סיבים אופטיים כדי לנטר את הטמפרטורות בתוך הגידול, ליבת החיה וסביבת בעלי החיים או לצורך מחקרים במבחנה, ניטור הטמפרטורה של גלולת התא והמים המקיפים את הצינורות.</li>
	<li>השתמש בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מגנטית בגודל 100 ננומטר לכל הניסויים. הערה: ריכוז וקצב ספיגה ספציפי (SAR) הם שני מאפיינים שיש לקחת בחשבון בעת בחירת ננו-חלקיקים, מכיוון שהם משפיעים ישירות על המינון האפשרי של חימום ותרמי18.</li>
</ol>2. היפרתרמיה במבחנה
<ol><li>תרבית B16F10 מורין מלנומה תאים במדיית RPMI עם 10% FBS ו-1% עט/סטרפ. צלחת 150, 000 תאים / באר ב 6 צלחות היטב, עם 2 מ"ל של בינוני שלם.</li>
	<li>לקבוע את הטיפול המתאים לכל באר, כלומר, תאים ללא mNPs וללא AMF, תאים עם mNPs וללא AMF, תאים ללא mNPs ו- AMF, תאים עם mNPs ו- AMF. הערה: בנוסף, ודא שיש בקרות מתאימות אם משלבים היפרתרמיה עם טיפול אחר. AMF מבוצעת במעבדת ספסל מחקר סטנדרטית עם יכולות ההספק והקירור הדרושות.</li>
	<li>24 שעות לאחר הציפוי, יש להוסיף mNPs לבארות המתאימות כפי שנקבע בשלב הקודם. יש להוסיף mNPs לריכוז של 3 מ"ג ברזל/מ"ל. ודא שה-mNPs מופצים ברחבי הבאר, בין אם על ידי יצירת תמיסת מדיה/mNP (הסרת מדיה ישנה, הוספת תמיסה זו) או על-ידי הוספת לוחות mNPs ישירות ובעדינות לפיזור הומוגני.</li>
	<li>התחל את הטיפול, 48 שעות לאחר הוספת mNPs, כאשר בארות הם ~ 80% נפגש, על ידי הסרת המדיה ושטיפת בארות עם מדיה טרייה. הסר את המדיה.</li>
	<li>יש להוסיף 0.5 מ"ל של טריפסין לכל אחד מהמטופלים היטב, ולסובב בעדינות. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק שהתאים מנותקים.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מדיה לכל באר כדי לאסוף את התאים לתוך צינורות 1.5 מ"ל. לאסוף את כל התאים מן הבאר (~ 1 x 106 תאים). השתמש בצינור נפרד מסומן בבירור עבור כל באר.</li>
	<li>סובב צינורות ב 60 x גרם במשך 2-3 דקות כדי לאפשר לתאים כדור. שמור את הכדור בתקשורת.</li>
	<li>מניחים צינורות במרווח מלא מים בתוך הסליל. הגדר את הטמפרטורה של אמבט המים כך שהמדיה וכדור התא נשמרים ב 37 מעלות צלזיוס. עקוב אחר הטמפרטורה בתוך הצינור ואמבט המים באמצעות בדיקות טמפרטורה נפרדות של סיבים אופטיים.</li>
	<li>הפעל את הצ'ילר, בדוק כי נוזל הקירור זורם דרך הסליל. הפעל את מקור החשמל והתאם את אחוז המקסימום לשדה הרצוי. הפעל את סליל הסולנואיד בעל 14 הסיבובים, המופעל על ידי גנרטור של 10 קילוואט, במהירות של 165 קילו-הרץ ו-23.87 kA/m (300 Oe).</li>
	<li>הכניסו בדיקה נפרדת של טמפרטורת סיב אופטי לתוך אחד הצינורות. לטפל בתאים עד מינון תרמי פרוטוקול שנקבע בעבר. דוגמה לכך היא 30 דקות ב-43 מעלות צלזיוס (CEM43 מתוך 30).</li>
	<li>יש לתלות מחדש תאים במדיה שנמצאת בצינורות שלהם ולהפוך אותם מחדש ל-6 לוחות באר חדשים. תייג בבירור את הלוחות החדשים. המטרה היא לצלוח מחדש את כל התאים שנאספו (~1 x 106 תאים). הערה: יש להשתמש ב-6 צלחות באר חדשות כדי להבטיח שהתאים שעברו תרבית יקבלו טיפול. אם משתמשים בצלחות הישנות עדיין יכולים להישאר תאים על הצלחות שלא עברו טריפסינציה מוצלחת.</li>
	<li>במידת הצורך, עבור ההליך הניסויי הבא, lyse את התאים עבור RNA או ניתוח ביטוי חלבון.</li>
</ol>3. היפרתרמיה in vivo
<ol><li>תרבית תאים וחיסון<ol><li>תרבית B16F10 מורין מלנומה תאים במדיית RPMI עם 10% FBS ו-1% עט/סטרפ. השתמש בצלחות / כלים שיספקו מספיק תאים לחיסון מספר בעלי החיים הרצוי. לדוגמה, 10, 100 מ"מ מנות, מצופה ב 100, 000 תאים יהיה מפגש עם מספיק תאים עבור 20 עכברים זריקות בתוך 48 שעות.</li>
		<li>טריפסיניזציה של תאים ואיסוף באמצעות מדיית RPMI טהורה (ללא FBS או עט/סטרפ).</li>
		<li>לספור תאים וליצור פתרון לריכוז התאים הרצוי, בהתבסס על נפח החיסון, ומספרי העכברים.</li>
		<li>הרדימו נקבות C57Bl/6 עכברות בנות 6 שבועות באמצעות איזופלורן וחמצן מאודים. הכניסו בעלי חיים לקופסת פרספקס עם 5% איזופלוראן ו-95% חמצן עד להשרה. לאחר ההשרה, יש להסיר את בעלי החיים ולהשתמש בקונוס פנים ב-2% איזופלוראן כדי להשלים את שלבים 3.1.5-3.1.7 ו-3.3.3-3.3.6. הערה: להרדמה במהלך הטיפול יש להשתמש בהכלת הרדמה מובנית. עקוב אחר פרוטוקולים מוסדיים סטנדרטיים להרדמה בעכבר. לפני ניסויים בבעלי חיים יש לוודא אישור IACUC מתאים. לאחר ההרדמה, החזירו את החיה לכלוב ועקבו אחר ההתאוששות כדי להבטיח שלא יהיו סיבוכים.</li>
		<li>בדוק את חוסר התגובה לרפלקסים הנכונים.</li>
		<li>לגלח את האגף הימני באמצעות מכונת גילוח חשמלית.</li>
		<li>נקו את אזור ההזרקה עם מגבון אלכוהול. להזריק 1-2 x 106 תאים , באמצעות מזרק זכוכית 100 μL עם מחט 28 גרם, מפוזר ב 50 μL של מדיה intradermally על האגף הימני מגולח של מורדם.</li>
	</ol></li>
	<li>גידול גידול/הזרקת ננו-חלקיקים<ol><li>מדוד גידולים בשלושה ממדים באמצעות קליפרים (אורך, רוחב ועומק), וחשב נפחים לפי (אורך x רוחב x עומק x π)/6.</li>
		<li>כאשר נפחי הגידול מגיעים ל-120 מ"מ 3 (+/- 20 מ"מ3), הניחו את בעלי החיים במחקר. תכנן את המחקר, כדי לוודא שקיימות קבוצות בקרה וטיפול מתאימות הכוללות קבוצות טיפול משולבות (כלומר, בקרה, mNPH, קרינה והשילוב).</li>
		<li>הרדמת עכברים שיקבלו mNPs כמתואר ב-3.1.4.</li>
		<li>נקו את האזור עם מגבון אלכוהול. יש להזריק mNPs לגידול 3 שעות לפני טיפול AMF. להזריק נפח כזה שהמינון הוא 7.5 מ"ג ברזל/ס"מ3 של גידול. הערה: נתונים שלא פורסמו מהמעבדה מצביעים על ספיגת mNP מקסימלית המתרחשת ב-3-6 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>טיפול AMF<ol><li>מרדימים את העכבר ומניחים על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הליבה.</li>
		<li>בדוק את חוסר התגובה לרפלקסים הנכונים. הסר את תג האוזן או כל חפץ מתכתי אחר על העכבר.</li>
		<li>יש להניח בעדינות בדיקת טמפרטורה של סיב אופטי משומן לתוך פי הטבעת של העכבר.</li>
		<li>מכניסים קטטר לתוך הגידול, מסירים את המחט. חותכים את הקטטר כך שהוא לא יבלוט מהגידול יותר מדי. הערה: צנתרי הטמפרטורה הפיברופטיים ממוקמים ומוסרים בזמן שהעכברים נמצאים בהרדמה כללית, כלומר, הצנתרים נמצאים במקומם רק במהלך הליך חימום הגידול. עכברים מקבלים מנה תת עורית אחת של תרופה משככת כאבים NSAID, קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג), בזמן ההליך. לא ראינו אי נוחות או תחלואה בטווח הקצר או הארוך הקשורה למיקום הצנתרים.</li>
		<li>הכנס בדיקת טמפרטורה של סיב אופטי בעל 3 חיישנים לתוך הקטטר. הקטטר מגן על חיישני בדיקת הטמפרטורה של הסיבים האופטיים.</li>
		<li>הדביקו את הבדיקה הרקטלית והתוך-גופית לזנב החיה כדי להבטיח שהם יישארו במקומם.</li>
		<li>הכנס את העכבר לתוך צינור 50 מ"ל, ראש לתחתית. הצינור צריך להיות חור ליד הראש שבו ההרדמה תהיה מחוברת ומועברת.</li>
		<li>מקם את הצינור בתוך מערך הסליל וחבר מחדש את ההרדמה.</li>
		<li>הכניסו בדיקת טמפרטורה של סיבים אופטיים באופן רופף לתוך הצינור כדי למדוד את טמפרטורת הסביבה.</li>
		<li>הפעל את הצ'ילר, וודא שנוזל הקירור מופץ.</li>
		<li>בדוק וודא שתוכנת המחשב מציגה את הטמפרטורות השונות והתחל להקליט כדי לאפשר הצגת חישוב CEM43 בזמן אמת. ה- CEM43 הנדרש הוא המינון שנקבע בעבר. הערה: לפני הפעלת המגנט, ודא שאין פריטי מתכת מחוברים לבעל החיים, מכיוון שהם יתחממו במהירות. בנוסף, ודא שלכל מי שנמצא בחדר אין קוצב לב ושהוא בטוח להיות שם.</li>
		<li>הפעל את המגנט באחוז הספק נמוך.</li>
		<li>ודא שבדיקות טמפרטורת הסיבים האופטיים רושמות שינויי טמפרטורה. הטמפרטורות יעלו ברגע שה-AMF יופעל ככל שהשדה יגדל. ודא שטמפרטורת הליבה של החיה נשארת ב -38 מעלות צלזיוס. ווסת את טמפרטורת הליבה באמצעות מעיל האוויר הממוזג.</li>
		<li>התאם את עוצמת השדה המגנטי על ידי שינוי הכוח בגנרטור, באמצעות חוגת הבקרה המובנית, אשר בתורה שולטת ברמת הטמפרטורה בגידול.</li>
		<li>כבה את AMF פעם אחת המינון הרצוי, כפי שנקבע בעבר על ידי המשתמש (למשל CEM43 40), מושגת בתוך הגידול.</li>
		<li>לאחר כיבוי ה- AMF, הסר את הצינור מהסליל.</li>
		<li>הסר את העכבר מן הצינור, חילוץ בדיקות שונות קטטר. במידת הצורך, תייג את החיה בתג אוזן מתכתי חדש.</li>
		<li>לאחר סיום הטיפולים, כבה את הצ'ילר.</li>
		<li>לשחזר את בעלי החיים מן ההרדמה להבטיח שום סיבוכים. עקוב אחר התנהגותם כדי להבטיח חזרה לשגרה.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Chen, X., Tan, L., Liu, T., Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-Nanomaterials+for+Tumor+Microwave+Hyperthermia:+Design,+Preparation,+and+Application.">Micro-Nanomaterials for Tumor Microwave Hyperthermia: Design, Preparation, and Application.</a> Current Drug Delivery. 14 (3), 307-322 (2016).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+radiofrequency+ablation+versus+other+ablating+techniques+on+hepatocellular+carcinomas:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Effects of radiofrequency ablation versus other ablating techniques on hepatocellular carcinomas: A systematic review and meta-analysis.</a> World Journal of Surgical Oncology. 15 (1), 126 (2017).</li><li>Ter Haar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+and+sound:+Focused+ultrasound+in+the+clinic.">Heat and sound: Focused ultrasound in the clinic.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 223-224 (2015).</li><li>Salunkhe, A. B., Khot, V. M., Pawar, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Hyperthermia+with+Magnetic+Nanoparticles:+A+Status+Review.">Magnetic Hyperthermia with Magnetic Nanoparticles: A Status Review.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (5), 572-594 (2014).</li><li>Dewhirst, M. W., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hanson, M., Hoopes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+thermal+dosimetry+and+thermal+thresholds+for+tissue+damage+from+hyperthermia.">Basic principles of thermal dosimetry and thermal thresholds for tissue damage from hyperthermia.</a> International Journal of Hyperthermia. 19 (3), 267-294 (2003).</li><li>Roizin-Towle, L., Pirro, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+human+and+rodent+cells+to+hyperthermia.">The response of human and rodent cells to hyperthermia.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 20 (4), 751-756 (1991).</li><li>Hergt, R., Dutz, S., M&#252;ller, R., Zeisberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+particle+hyperthermia:+Nanoparticle+magnetism+and+materials+development+for+cancer+therapy.">Magnetic particle hyperthermia: Nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy.</a> Journal of Physics Condensed Matter. 18 (38), (2006).</li><li>Kumar, C. S. S. R., Mohammad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanomaterials+for+hyperthermia-based+therapy+and+controlled+drug+delivery.">Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (9), 789-808 (2011).</li><li>Stigliano, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitigation+of+eddy+current+heating+during+magnetic+nanoparticle+hyperthermia+therapy.">Mitigation of eddy current heating during magnetic nanoparticle hyperthermia therapy.</a> International Journal of Hyperthermia. 32 (7), 735-748 (2016).</li><li>Johannsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+hyperthermia+of+prostate+cancer+using+magnetic+nanoparticles:+Presentation+of+a+new+interstitial+technique.">Clinical hyperthermia of prostate cancer using magnetic nanoparticles: Presentation of a new interstitial technique.</a> International Journal of Hyperthermia. 21 (7), 637-647 (2005).</li><li>Horsman, M. R., Overgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermia:+a+Potent+Enhancer+of+Radiotherapy.">Hyperthermia: a Potent Enhancer of Radiotherapy.</a> Clinical Oncology. 19 (6), 418-426 (2007).</li><li>Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Kaufman, P. A., Hoopes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticle+hyperthermia+enhancement+of+cisplatin+chemotherapy+cancer+treatment.">Magnetic nanoparticle hyperthermia enhancement of cisplatin chemotherapy cancer treatment.</a> International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 845-851 (2013).</li><li>Peeken, J. C., Vaupel, P., Combs, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+hyperthermia+into+modern+radiation+oncology:+What+evidence+is+necessary.">Integrating hyperthermia into modern radiation oncology: What evidence is necessary.</a> Frontiers in Oncology. 7, 132 (2017).</li><li>Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Trembly, B. S., Hoopes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+magnetic+nanoparticle+and+microwave+hyperthermia+cancer+treatment+methodology+and+treatment+effect+in+a+rodent+breast+cancer+model.">Comparison of magnetic nanoparticle and microwave hyperthermia cancer treatment methodology and treatment effect in a rodent breast cancer model.</a> International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 819-827 (2013).</li><li>Stigliano, R. V., Shubitidze, F., Petryk, A. A., Tate, J. A., Hoopes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticle+hyperthermia:+predictive+model+for+temperature+distribution.">Magnetic nanoparticle hyperthermia: predictive model for temperature distribution.</a> Energy-based Treatment of Tissue and Assessment VII. 8584, 858410 (2013).</li><li>Dewhirst, M., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hoopes, P. J., Hanson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+dose+requirement+for+tissue+effect:+experimental+and+clinical+findings.">Thermal dose requirement for tissue effect: experimental and clinical findings.</a> Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment II. 4954, 37 (2003).</li><li>Duval, K. E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenetic+effects+of+low+dose+(CEM43+30)+magnetic+nanoparticle+hyperthermia+and+radiation+in+melanoma+cells.">Immunogenetic effects of low dose (CEM43 30) magnetic nanoparticle hyperthermia and radiation in melanoma cells.</a> International Journal of Hyperthermia. 36, 37-46 (2019).</li><li>Giustini, A. J., Petryk, A. A., Cassim, S. M., Tate, J. A., Baker, I., Hoopes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Nanoparticle+Hyperthermia+in+Cancer+Treatment.">Magnetic Nanoparticle Hyperthermia in Cancer Treatment.</a> Nano LIFE. 01, 17-32 (2010).</li><li>Hoopes, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+iron+oxide+nanoparticle+hyperthermia+and+radiation+cancer+treatment.">Intratumoral iron oxide nanoparticle hyperthermia and radiation cancer treatment.</a> Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment IV. 6440, (2007).</li><li>Semiatin, S. L., Zinn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coil+design+and+fabrication+basic+design+and+modifications.">Coil design and fabrication basic design and modifications.</a> Heat Treating. , 32-41 (1988).</li><li>Maxwell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+physical+lines+of+force.">On physical lines of force.</a> The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 21 (139), 161-175 (1861).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

התכנון והיישום של מערכת זו מספק את היכולת לבצע ניסויים מדויקים וניתנים לשחזור בהיפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים in vivo ו- in vivo. זה קריטי שהמערכת מתוכננת כך שהתדר ועוצמת השדה של AMF יותאמו כראוי לסוג הננו-חלקיקים המגנטיים, לריכוז ולמיקום הרקמה ולטמפרטורה הרצויים. בנוסף, ניטור מדויק של הטמפרטור...

היפרתרמיה שימשה בעבר בטיפול בסרטן, לבדה או בשילוב עם טיפולים אחרים. למרות שיש לו היסטוריה ארוכה של שימוש, השיטה הטובה ביותר למתן טיפול זה עדיין נתונה לוויכוח והיא תלויה באתר המחלה ובמיקום. שיטות להעברת היפרתרמיה כוללות מיקרוגל, גלי רדיו, אולטרסאונד ממוקד, לייזר וננו-חלקיקים מתכתיים (כגון תחמוצת זהב או ברזל)1,2,3,4. שיטות אספקה אלה יכולות להוביל למגוון טמפרטורות טיפול מרמת חום ועד מאות מעלות צלזיוס. ההשפעה הביולוגית של היפרתרמיה תלויה בעיקר בטמפרטורות המשמשות ובמשך הטיפול5. לשם כך אנו מתמקדים בהיפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים (mNPH). שיטה זו מאפשרת שינויי טמפרטורה ממוקדים, מקומיים, מנוטרים היטב ומבוקרים, תוך שימוש בננו-חלקיקים לא רעילים, מאושרים על ידי ה-FDA.
מלכודת אחת של אופני היפרתרמיה אחרים היא היעדר מיקוד תאי מדויק; היפרתרמיה אין יחס טיפולי גבוה מטבעו, ולכן, תרמומטריה זהירה ומיקוד הוא הכרחי6. mNPH מאפשר הזרקה מערכתית או תוך-גופית של mNPs, כאשר החום נוצר רק במקום שבו ממוקמים ה-mNPs, ובכך מכוון את הטיפול ישירות לגידול. mNPH יכול להיות יעיל כאשר הננו-חלקיקים המגנטיים ממוקמים בתוך התא או מחוצה לו. עבור טיפול בסרטן, הסקירה הכללית של mNPH היא כי ננו-חלקיקים מגנטיים מוזרקים (תוך כדי או תוך ורידי), ואז מופעל שדה מגנטי לסירוגין, מה שגורם לקטבים המגנטיים של ננו-חלקיקים להתיישר מחדש כל הזמן, מה שמוביל לחימום מקומי של התאים והרקמות הקשורים לננו-חלקיקים 7,8 . על ידי התאמת נפח הננו-חלקיקים והתדר/חוזק של השדה המגנטי המתחלף (AMF), ניתן לשלוט בקפידה בטמפרטורה הנוצרת בתוך הרקמה.
טיפול זה פועל היטב בגידולים הקרובים לפני השטח של הגוף, שכן גידולים עמוקים יותר דורשים AMF חזק יותר ולכן הסיכון לחימום זרם אדי עולה9. ישנן עדויות לשימוש בהיפרתרמיה קלינית כמונותרפיה, אולם לעתים קרובות היפרתרמיה משולבת עם הקרנות או כימותרפיה, מה שמוביל לאפקט אנטי-סרטני ממוקד יותר10,11,12. עדויות קליניות לכך שהיפרתרמיה פועלת בשילוב עם הקרנות נבדקות בפרסום קודם13. המעבדה שלנו טיפלה בהצלחה במגוון בעלי חיים, מעכברים ועד חזירים וסרטן כלבים ספונטני, בשיטת mNPH12,14,15. פרוטוקול זה מיועד למעוניינים לחקור את ההשפעות של טיפול היפרתרמיה מקומי, לבד או בשילוב עם טיפולים אחרים.
אחד הגורמים החשובים ביותר בהיפרתרמיה הוא היכולת למדוד ולהבין, בזמן אמת, את המינון התרמי המועבר לרקמת המטרה/הגידול. דרך סטנדרטית לחישוב והשוואת מינון היא באמצעות הדגמה של דקות שוות ערך מצטברות של חימום ב 43 מעלות צלזיוס; אלגוריתם זה מאפשר השוואה של מנות ללא תלות במערכת האספקה, טמפרטורות מקסימום ומינימום (בטווח מסוים) ופרמטרים לחימום/קירור 5,16. חישוב CEM עובד בצורה הטובה ביותר עבור טמפרטורות בין 39-57 מעלות צלזיוס5. לדוגמה, בחלק מהמחקרים שביצענו, בחרנו מנה תרמית של CEM43 30 (כלומר, 30 דקות ב 43 מעלות צלזיוס). בחירת מינון זה אפשרה לנו להסתכל על השפעות אימונוגנטיות בטוחות, יעילות, במבחנה, הן לבד, והן בשילוב עם מנה אחת של קרינה17.
עם היפרתרמיה ננו-חלקיקית מגנטית, ישנם מספר גורמים שיש לקחת בחשבון בבניית מערכת אספקה מתאימה. תכנון המכשור כולל גורמי בטיחות חשובים, כגון שימוש בצ'ילר כדי להבטיח שציוד אספקת השדה המגנטי יישאר קריר גם כאשר הוא מופעל בהספק גבוה, ונהלים בטוחים לכשל המונעים את הפעלת המערכת אם כל הטמפרטורה, הערכת ההספק ומערכות הבקרה לא הופעלו. בנוסף, ישנם גורמים ביולוגיים חשובים שיש לקחת בחשבון הן עבור מצבים in vivo והן עבור מצבים במבחנה. בעת שימוש בתאים בתרבית, יש צורך לטפל במדיה צמיחה ולשמור על טמפרטורה קיימא עקבית כדי למנוע שינויים פיזיולוגיים שעלולים להשפיע על התוצאות. עבור סוגי ננו-חלקיקים בודדים, חשוב לדעת את קצב הספיגה הספציפי (SAR) בעת חישוב פרמטרי חימום מבוססי AMF. באופן דומה, חשוב לדעת את ריכוז ה-mNP/Fe, בתאים וברקמות, הנחוץ להשגת החימום הרצוי. שיטות in vivo דורשות תשומת לב רבה עוד יותר לפרטים מכיוון שיש לשמור על בעל החיים תחת הרדמה במהלך הטיפול וטמפרטורת הגוף המרכזית של החיה נשמרת ברמה נורמלית לאורך כל הטיפול. מתן אפשרות לטמפרטורת הגוף של בעל החיים לרדת, כפי שקורה בהרדמה, יכול להשפיע על התוצאות הכוללות, ביחס למינון התרמי של הרקמה המטופלת.
בכתב יד זה אנו דנים בשיטות המשמשות לתכנון ובנייה של מערכת היפרתרמיה רב-תכליתית של ננו-חלקיקים מגנטיים, כמו גם בגורמי שימוש חשובים שיש לקחת בחשבון. המערכת המתוארת מאפשרת העברה חזקה, עקבית, מתאימה ביולוגית, בטוחה ומבוקרת היטב של היפרתרמיה ננו-חלקיקית מגנטית. לבסוף, יש לציין כי מחקרי mNPH שאנו עורכים כוללים לעתים קרובות טיפולים אחרים כגון הקרנות, כימותרפיה ואימונותרפיה. כדי שתוצאות אלה יהיו משמעותיות, חשוב לקבוע כיצד החום המועבר יכול להשפיע על היעילות ו/או הרעילות הבטיחותית של שיטות אחרות (או להיפך) ועל רווחת החיה. מסיבה זו והדוזימטריה והמצבים הטיפוליים שהוזכרו קודם לכן, חיוני להקדיש תשומת לב קפדנית לדיוק מינון ההיפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים ולמדידות הליבה וטמפרטורת היעד המתמשכות. מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה ותיאור פשוטים ועקביים להעברת היפרתרמיה בטוחה ויעילה של ננו-חלקיקים מגנטיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-664</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 22363204</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10 murine melanoma cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/Bl6 mice</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>027C57BL/6</td>
			<td>6-week-old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller</td>
			<td>Thermal Care</td>
			<td>NQ 5 series</td>
			<td>chiller that cools the coil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolant fluid</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>Dowtherm SR-1</td>
			<td>antenna cooling fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic probes, software and chassis</td>
			<td>FISO</td>
			<td></td>
			<td>FISO evolution software used to read the temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR camera</td>
			<td>Flir</td>
			<td></td>
			<td>infrared camera to monitor unintentional heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron oxide nanoparticles</td>
			<td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td>
			<td>Bionized NanoFerrite</td>
			<td>dextran coated iron oxide nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse coil, solenoid</td>
			<td>Fluxtrol</td>
			<td>custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-652</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF generator</td>
			<td>Huttinger</td>
			<td>TIG 10/300</td>
			<td>power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-396</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo delivery of magnetic nanoparticle hyperthermia using a custom-built delivery system

היפרתרמיה כבר זמן רב בשימוש בטיפול בסרטן. הטכניקות השתנו מהחדרה תוך-גידולית של מוטות ברזל חמים, לננו-חלקיקים מגנטיים ממוקדי נוגדנים לגידול באופן שיטתי, בטמפרטורות של 39 מעלות צלזיוס (רמת חום) עד 1,000 מעלות צלזיוס (אלקטרוקאוטריה) וזמני טיפול משניות עד שעות. הקשר בין הטמפרטורה לזמן (מינון תרמי) מכתיב את האפקט עם מינונים תרמיים גבוהים וכתוצאה מכך אבלציה של הרקמה ומינונים תרמיים נמוכים יותר וכתוצאה מכך השפעות תת-קטלניות כגון זרימת דם מוגברת, הצטברות של תרופות וגירוי חיסוני. אחד הטיפולים הרפואיים המבטיחים ביותר כיום הוא היפרתרמיה ננו-חלקיקית מגנטית (mNPH). טכניקה זו כוללת הפעלת ננו-חלקיקים מגנטיים, שיכולים להיות מועברים באופן מערכתי או תוך-גופי, עם שדה מגנטי חלופי לא פולשני ולא רעיל. הגודל, המבנה והקשר של הננו-חלקיקים המגנטיים והתדר ועוצמת השדה של השדה המגנטי הם גורמי חימום עיקריים. פיתחנו מכשור וטכניקות מתוחכמות להעברת היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים הניתנים לשחזור במודלים של בעלי חיים גדולים וקטנים ובתאים בתרבית. גישה זו, תוך שימוש בניטור טמפרטורה רציף בזמן אמת במספר מקומות, מאפשרת מתן מנות תרמיות מוגדרות היטב לרקמת המטרה (הגידול) או לתאים תוך הגבלת חימום רקמות שאינן מטרה. בקרה וניטור מדויקים של הטמפרטורה, במספר אתרים, ושימוש באלגוריתם הסטנדרטי בתעשייה (דקות שוות ערך מצטברות ב- 43 °C / CEM43), מאפשרים קביעה וכימות מדויקים של מינון תרמי. המערכת שלנו, המאפשרת מגוון רחב של טמפרטורות, מינונים תרמיים והשפעות ביולוגיות, פותחה באמצעות שילוב של רכישות מסחריות ופיתוחים הנדסיים וביולוגיים פנימיים. מערכת זו עברה אופטימיזציה באופן המאפשר המרה מהירה בין טכניקות ex vivo, in vitro ו- in vivo. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לתכנן, לפתח וליישם טכניקה ומערכת יעילה להעברת היפרתרמיה של טיפול בננו-חלקיקים מגנטיים (mNP) הניתנת לשחזור ומדויק.

מחקרים במבחנה התאים ישיגו וישמרו על הטמפרטורה והמינון התרמי הרצויים רק אם הכמות והריכוז של הננו-חלקיקים/הברזל המגנטיים וה-AMF מותאמים כראוי. בעת שימוש בננו-חלקיקים מגנטיים לחימום תאים במבחנה (וב-in vivo), יש לציין כי כדי להשיג היפרתרמיה בתאים עם ננו-חלקיקים מגנטיים מופנמים, יהיה צור?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

פרוטוקול זה מציג טכניקות ומתודולוגיות הדרושות להעברה מדויקת של היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים באמצעות מערכת אספקה וניטור מתוחכמת.

העברת in vitro ו- in vivo של היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים באמצעות מערכת אספקה שנבנתה בהתאמה אישית

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

in-vitro-vivo-delivery-magnetic-nanoparticle-hyperthermia-using

Research

JoVE Journal

Medicine

4.2K Views.  Dartmouth College. פרוטוקול זה מציג טכניקות ומתודולוגיות הדרושות להעברה מדויקת של היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים באמצעות מערכת אספקה וניטור מתוחכמת.

Video: In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

אקס תרבות Vivo של רקמות החולה &amp; בחינת משלוח ג&#39;ין

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

רב מודלי הדמיה של אנגיוגנזה מודל עכברים עירום של גרורות סרטן השד עצם באמצעות דימות תהודה מגנטית, טומוגרפיה ממוחשבת נפחית ו אולטראסאונד

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

משלוח הנייד intramyocardial: תוכן בלבבות Murine

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

משלוח שחרור איטי תרופות דרך Elvax 40W לרשתית העכברוש: ​​השלכות לטיפול במצבים כרוניים

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT): מערכת לא פולשני, ריאות ספציפי משלוח

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

טלמטריה תוך רחמי למדידת לחץ עכבר התכווצות<em&gt; In vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling molecules that affect multiple organs; they modulate gut motility and hormone production, and alter vascular tone, glucose metabolism, lipid metabolism, and energy utilization. Changes in fecal bile acids may alter the gut microbiome and promote colon pathology including cholerrheic diarrhea and colon cancer. Key regulators of fecal bile acid composition are the small intestinal Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter (ASBT) and fibroblast growth factor-19 (FGF19). Reduced expression and function of ASBT decreases intestinal bile acid up-take. Moreover, in vitro data suggest that some FDA-approved drugs inhibit ASBT function. Deficient FGF19 release increases hepatic bile acid synthesis and release into the intestines to levels that overwhelm ASBT. Either ASBT dysfunction or FGF19 deficiency increases fecal bile acids and may cause chronic diarrhea and promote colon neoplasia. Regrettably, tools to measure bile acid malabsorption and the actions of drugs on bile acid transport in vivo are limited. To understand the complex actions of bile acids, techniques are required that permit simultaneous monitoring of bile acids in the gut and metabolic tissues. This led us to conceive an innovative method to measure bile acid transport in live animals using a combination of proton (1H) and fluorine (19F) magnetic resonance imaging (MRI). Novel tracers for fluorine (19F)-based live animal MRI were created and tested, both in vitro and in vivo. Strengths of this approach include the lack of exposure to ionizing radiation and translational potential for clinical research and practice.

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Tools to diagnose bile acid malabsorption and measure bile acid transport in vivo are limited. An innovative approach in live animals is described that utilizes combined proton (1H) plus fluorine (19F) magnetic resonance imaging; this novel methodology has translational potential to screen for bile acid malabsorption in clinical practice.

שימוש רב-פלואור מרת חומצות<em&gt; In vivo</em&gt; דימות תהודה מגנטית כדי למדוד חומצות מרה התחבורה

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...