שורות תאי HCC4017 וHBEC30KT נמסרו באדיבות על ידי המעבדה של ד&quot;ר ג&#39;ון מינה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות ססיל ה &#39;ואידה הירוקה לד&quot;ר לי ג&#39;אנג.

זהירות: בעת שעבדה עם רדיואקטיביות, לנקוט באמצעי זהירות מתאימה כדי למנוע זיהום של הנסיין והסביבה. השלך את כל הפסולת הבאה הנחיות בטיחות קרינה מקומיות. 1. הכנת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בצלחות 3.5 סנטימטר כך שconfluency מגיע 80% -90% ביום assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב שזריעת confluency לתאים תלויה בסוג התא וקצב הצמיחה שלהם. כאשר טיפול בתאים עם מגיב למספר מסוים של ימים, תאי זרע, כך שconfluency הוא 80% -90% ביום מדידת heme. אם מספר התאים המתקבלים מצלחות 3.5 סנטימטר אינו מספיק, השתמש 6 צלחות סנטימטר עם אותה הכמות של ALA רדיואקטיבי כמו בשלב הבא. הערה: שימוש בצלחות אישיות מומלצת כי זה קל יותר לטפל צלחות בודדות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני מדידת heme, להוסיף .1-0.3 μCi [14 C] 5-עלא וALA הקר להגיע ג סופיoncentration של 20 מיקרומטר של ALA המוחלט לכל מנה תרבות באזור העבודה מתאימה לעבודה עם חומרים רדיואקטיביים ולשים את הצלחות בחזרה לתוך החממה. באופן אידיאלי, דגירה עם ALA רדיואקטיבי במשך 16 שעות. הערה: radiolabeled 5-ALA הנדרש עשויים להשתנות בין שורות תאים. ספירה רדיואקטיביים לדקה (CPM) של לפחות 100 נדרש כדי למזער את השגיאה הקשורות לספירה. מומלץ לקבוע סכום מינימאלי של [14 C] 5-ALA נדרש לשורות תאים תחת מחקר. עבור רוב הניסויים .1-0.3 μCi מספיק כדי לקבל מדידה טובה. תוספת של ALA הקר היא אופציונלית. </li></ol> 2. הרן הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים תרבית תאים על קרח ולקחת אותם לאזור כשיר לעבודת רדיואקטיביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל ההפקה ותהליך אידוי במכסת מנוע חסין פיצוץ. בגלל האתר מאוחסן יכול להתפוצץ, להשתמש באתר בבקבוקים קטנים ולהתאדות כל נוזלים שנותרו, לא שומר את אתר בבקבוק פתוח יותר מאחד בחודש. אין להשתמש באצטון ליד להבות ומחממים פתוחים כפי שהוא דליק מאוד. אצטון חנות המכיל חומרים כימיים בבקבוקי זכוכית כפי שהוא מתמוסס פלסטיק בתרבית רקמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום באמצעות פיפטה. לשטוף את תאים פעם אחת עם 1 מיליליטר של PBS הקר 1x. לשאוב את PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של PBS הקר 1x לצלחות ולאסוף את התאים בחלק התחתון של הצלחת באמצעות שוטר גומי. להעביר את התאים שנאספו מכל צלחת לצינור מיליליטר 2 טרום צוננים שכותרת. לאסוף את כל התאים במ&quot;ל 2 צינורות. הערה: השתמש שוטר גומי טרי לכל צלחת לגירוד תאים מכל צלחת. לכל צלחת היית דורש ארבעה 2 מיליליטר צינורות, צינור 1.5 מיליליטר ובקבוקון נצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב15,000 XG דקות 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את PBS באמצעות פיפטה, לתת ספין קצר ולהסיר את PBS השייר. תאים גלולים בשל 1x PBS 100 μl. מערבולת כדי resuspend תאים ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 ו956 #; l מהשלב 5 ולהעביר צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולאחסן על קרח למדוד ריכוז חלבון. הערה: מאגר תמוגה תא יש להוסיף לתאים ושמר על קרח כדי למדוד ריכוז חלבון מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 90 μl שנותר מהשלב 5 בXG 5000 למשך 30 שניות ב 4 ° C; להסיר PBS באמצעות קצה פיפטה 200 μl לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 300 μl של חיץ חילוץ heme (ראה חומרי רשימה) על צינור אחד. אז מערבולת במשך 15 שניות כדי לערבב ולשים על קרח דק 1, לחזור על זה 3 פעמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ מיצוי heme (HEB) ומערבולת הצינור במהירות לresuspend גלולה, לעשות רק אחד או שני צינורות בזמן, כי גלולה צריכה להיות resuspended במהירות מבלי שהשאיר בHEB במשך זמן רב מדי. ברגע שHEB מתווסף לכל הצינורות וגלולים הוא resuspended לאחר מכן בצע את מערבולת 15 שניות ודקות 1 במחזור הקרח כמו בשלב הערה 8. שגלולה לא יכולה ללכת לגמרי לHEB אם גלולה נותרת במאגר HEB ל עודזמן ולא resuspended במהירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.2 מיליליטר של אתר diethyl על צינור אחד ומערבולת למשך 30 שניות. ספין ב15,000 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הערה: דיאתיל אתר נגמר טיפים פיפטה במהירות. כדי לשלוט בזה, אתר את diethyl פיפטה ולמטה פעם או פעמיים, בכך אעזור להחזיק את אתר diethyl בפיפטה. חזור על כל פעם שזה קצה פיפטה טרי משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר עליון שלב (אתר) עם פיפטה 1 מיליליטר לצינור microcentrifuge חדש. הוסף 0.5 מיליליטר של 2 N HCl, מערבולת לערבב וספין כמו בשלב 9. הערה: קשה לראות את ההפרדה בין שלבים ואתר HCl. לכן, להוסיף כמויות קטנות של Trypan כחול בפתרון 2 N HCl לשימוש במהלך הניסוי, מספיק כדי לתת לו צבע כחול חיוור. זה יעזור לי להבחין בין שני השלבים. השלב נמוך יותר יהיה כחול והשלב העליון האתר יהיה חסר צבע. מעבירים את שלב האתר חסר צבע העליון לצינור חדש וזורקים את השלב הנמוך HCl (הכחול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 10 שנייותר פעמים כדי לשטוף את שלב האתר עם 2 N HCl. מעבירים את השלב העליון האתר רק לצינור חדש במהלך כל חזרה וזורקים את שלב HCl נמוך יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף השלישי עם HCl, להעביר את השלב העליון עם פיפטה 1 מיליליטר לבקבוקון נצנץ. ייבש את הדגימות על ידי מתאדה אתר diethyl על ידי שמירה על הדגימות בO מכסה המנוע הכימי / N. </li></ol> 3. מדידה של רדיואקטיביות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להוסיף 5 מיליליטר של נוזל נצנץ לדגימות מיובשות מצעד 2.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער היטב כדי לערבב. מדוד את הרדיואקטיביות באמצעות מונה נצנץ. </li></ol> 4. חישובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים מצעד 2.6 באמצעות כמויות שווה של חיץ CelLytic M (ראו חומרי רשימה) וספין על 14,000 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של supernatant ולמדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת assay חלבון BCA. הסכום כולל של חלבון במ&quot;ג (TP) = (90 μl קונצרט כלשהו *. של חלבון ב81; ז / μl) / 1000 רמת heme סינתזה (רדיואקטיביות / TP) = pmol / מ&quot;ג של חלבון. </li></ol>

יש לנו מה למסור.

Heme ממלא תפקיד מרכזי בדור של אנרגיה תאית באמצעות נשימה 26. חילוף החומרים heme שינה ידוע להיות קשורים למחלות שונות, כוללים סרטן 28,41. עיכוב של סינתזת heme ידוע כגורם לעצירת מחזור התא ואפופטוזיס בתאי הלה 26,41. הוכח שרמת סינתזה הגבוהה heme קשור ההתקדמות של תאי סרט?...

Heme, קומפלקס של ברזל ברזלי ותשיעי protoporphyrin הוא מולקולה מרכזית להובלה וניצול חמצן באורגניזמים כמעט כל חיים 1-3. המבנה הייחודי של heme מאפשר לו לתפקד כנשא של גזים ואלקטרונים דו אטומיים, כמו גם לבצע פעולות שונות אחרות 1-5. לדוגמא, heme נקשר לחמצן בהמוגלובין ומיוגלובין להעברה והאחסון של 6,7 חמצן. זה עובד גם כמוביל אלקטרון בcytochromes במהלך נשימה ומשמש כתורם אלקטרונים לתגובות חמצון-חיזור מזורזות על ידי אנזימי ציטוכרום P450 8,9. אחת התכונות החשובות ביותר של heme הוא ש, הוא יכול לשחק תפקידי פיקוח בתהליכים תאיים ומולקולריים כגון שעתוק הגנים, סינתזת חלבון ומייקרו-רנ&quot;א biogenesis 4. לדוגמא, זה משפיע על השעתוק של גנים רבים על ידי שליטה על הפעילות של מדכאי תעתיק יונקים Bach1 וrec הגרעיני היונקיםeptor Rev-erbα 10-15. Heme מסדיר את הפעלת חלבון activator heme (האפ) 1 אשר ממלא תפקיד חשוב בהפעלה של גני המעורבים בנשימה ושליטה נזק חמצוני, בתגובה לheme או חמצן 16. Heme גם מסדיר שעתוק הגנים בתאים עצביים באמצעות גורם גדילה עצבית (NGF) איתות 3,17-20. זה גם מסדיר את סינתזת חלבון בתאי יונקים erythroid על ידי ויסות הפעילות של קינאז מוסדר heme eIF2α (HRI) 21-24. יתר על כן, heme משפיע על פעילותם של חלבוני איתות מפתח כגון טירוזין קינאז Jak2 וSrc, שהם חיוניים לתפקוד תאים תקין ו4,20,25 צמיחת תאים. נמצא כי בהלה עיכוב heme תאים גורם לעצירת מחזור התא והפעלה של סמנים הקשורים להזדקנות ומות תאים מתוכן 26. שני חסר הרן או הרמות הגבוהות של heme המשויכות השפעות בריאותיות חמורות בבני אדם 27. מולקולרי האחרוןND מחקרים אפידמיולוגיים הראו קשר חיובי של צריכת heme גבוהה וסיכון מוגבר למחלות, כגון סוכרת מסוג 2, מחלת לב כלילית וכמה סוגי סרטן, כולל סרטן הריאות, סרטן מעי גס וסרטן לבלב 27,28. בעזרת זוג תואם של המעבדה של המחברים תאי ריאה נורמלים והסרטן מצאו כי תאים סרטניים רמות גבוהות של צריכת חמצן, סינתזת heme וחלבונים המעורבים בספיגת heme וחמצן ניצול 28. מעניין לציין, עיכוב של סינתזת heme ירידה בצריכת חמצן, התפשטות, היווצרות הגירה ומושבה של תאים סרטניים 28. לפיכך, התנודות ברמות של heme אנדוגני ממלא תפקיד חשוב בויסות תהליכים מולקולריים ותאיים 3,4,28,29. ביונקים, ביוסינתזה של heme מתרחשת בשמונה שלבים, הכולל אנזימים הממוקמים במיטוכונדריה וcytosol 4 (איור 1). biosyn hemeתזה מתחילה במטריצה ​​של המיטוכונדריה עם העיבוי של גליצין וsuccinyl-CoA ליצירת חומצת 5-aminolevulinic (5-ALA), מזורז על ידי synthase ALA (אבוי) 4,31. זהו שיעור הגבלת צעד בביוסינתזה heme בתאי nonerythroid. 5-ALA לאחר מכן ייצא לcytosol בי ארבעה הצעדים הבאים להתרחש כדי ליצור coproporphyrinogen III (CPgenIII), אשר לאחר מכן מיובא חזרה למיטוכונדריה, שבו הוא הופך לIX protoporphyrin (PPIX). לבסוף, מולקולה אחת של ברזל משולב לIX protoporphyrin (PPIX) לייצר heme, תגובה מזורזת על ידי ferrochelatase (FECH) 2,4. רמת ביוסינתזה heme תלויה בעיקר ברמה של אנזים אבוי שנתונה לפיקוח הדוקה על ידי ברזל וheme 4 תאיים. ביוסינתזה של heme יכולה להיות מושפעת מפגמים גנטיים, זמינות של מינרלים מסוימים וויטמינים (למשל, ריבופלאבין, אבץ), חשיפה לרעלים (למשל, אלומיניום, עופרת), אנוקסיה, חום, ורמות של סטרואידים מסוימים (לדוגמא, אסטרוגן) 32-35. רמת סינתזת heme משתנה בתנאים חולים שונים. ביוסינתזה heme ירד יכולה לגרום לאנמיה, כמו גם מחלות נוירולוגיות 3,36. לחלופין, ביוסינתזה heme המוגברת ממלאת תפקיד חשוב בהתקדמות של סרטן מסוים 28,37. Heme הוכח להיות קריטי לצמיחה, הבידול וההישרדות של שומן יונקים, erythroid ותאים עצביים 4,38-41. לדוגמא, מחסור heme מוביל לנזק neurite בנוירונים בקליפת המוח עכבר העיקרי באמצעות העיכוב של גלוטמט NMDA (N -methyl-D-aspartate) קולטן 17. בנוסף, עיכוב של סינתזת heme גורם למות תאים מתוכנת בקרצינומה של צוואר רחם אפיתל אדם תאי הלה 26,41. לכן, מדידת רמות ביוסינתזה heme בתאים שונים בתנאים שונים חשובה ללימוד אטיולוגיה וprogressiבמחלות רבות. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ורגישה למדידת הרמה של סינתזת heme תאית באמצעות חומצת 5-aminolevulic [4 14 C]. זוהי שיטה חלופית לשיטות אחרות באמצעות 55 או 59 Fe Fe. אנחנו מעדיפים להשתמש 14 C כי הקרינה שלה היא חלשה מאוד. לעומת זאת, הגנה חזקה נדרשת לעבודה עם איזוטופים פה. יתר על כן, בשיטה זו נועדה למדוד ולהשוות סינתזת heme בתאים שונים במקביל באופן מהיר. על מנת למדוד את רמות heme מוחלטות, ניתן להשתמש בשיטה שהוקמה בעבר בתחום השימוש בHPLC 42,43.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Diethy ether</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>HCl (Hydrochloric acid)</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Scintillation cocktail&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>882470</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>Radiolabeled 4-&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C aminolevulinic acid</td><td>Perkin-Elmer life sciences</td><td></td><td>Store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CelLytic M</td><td>Sigma</td><td>C2978</td><td>Mammalian cell lysis reagent</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specific reagent&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Component&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Dispense&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Heme extraction buffer:&lt;br /&gt;Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)</td><td>Acetone&lt;br /&gt; Concentrated HCl&lt;br /&gt;Water</td><td>25 ml&lt;br /&gt;1.3 ml&lt;br /&gt;5 ml</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme משמש כקבוצה התותבת למגוון רחב של חלבונים המכונים hemoproteins, כגון המוגלובין, מיוגלובין וcytochromes. הוא מעורב בתהליכים מולקולריים ותאיים שונים כגון שעתוק הגנים, תרגום, התמיינות תאים וחלוקה של תאים. רמות ביוסינתזה של heme להשתנות על פני רקמות שונות וסוגי תאים ומשתנות בתנאים חולים כגון אנמיה, נוירופתיה וסרטן. טכניקה זו משתמשת [4 14 C] חומצת 5-aminolevulinic ([14 C] 5-ALA), אחד מהמבשרים המוקדמים במסלול ביוסינתזה heme כדי למדוד את הרמות של סינתזת heme בתאי יונקים. assay זה כרוך דגירה של תאים עם [14 C] 5-עלא ואחרי חילוץ של heme ומדידה של הרדיואקטיביות שולבה heme. הליך זה הוא מדויק ומהיר. שיטה זו מודדת את הרמות היחסית של ביוסינתזה heme ולא מוחלט תוכן heme. כדי להדגים את השימוש בtechn זהique הרמות של ביוסינתזה heme נמדדו בכמה שורות תאי יונקים.

שיטה זו משמשת להשוואת הרמות של סינתזת heme בנורמלי (HBEC30KT) לעומת סרטן תאים (HCC4017) ריאות. איור 2 מראה על רמה גבוהה יותר של סינתזת heme בתאי סרטן (HCC4017) מאשר בתאים רגילים ריאות (HBEC30KT). רמת סינתזת heme נמדדה גם בתאים נורמלים וסרטניים בנוכחות ציאניד קרבוניל uncoupler 3-chlorophenylhydrazo...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells at JoVE.com

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

measurement-of-heme-synthesis-levels-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Video: Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Synthesis and Catalytic Performance of Gold Intercalated in the Walls of Mesoporous Silica

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties of the materials were investigated. We used a one pot sol-gel approach to intercalate gold nano particles in the walls of mesoporous silica. To start with the synthesis, P123 was used as template to form micelles. Then TESPTS was used as a surface modification agent to intercalate gold nano particles. Following this process, TEOS was added in as a silica source which underwent a polymerization process in acid environment. After hydrothermal processing and calcination, the final product was acquired. Several techniques were utilized to characterize the porosity, morphology and structure of the gold intercalated mesoporous silica. The results showed a stable structure of mesoporous silica after gold intercalation. Through the oxidation of benzyl alcohol as a benchmark reaction, the GMS materials showed high selectivity and recyclability.

Here, we present a protocol with a sol-gel process to synthesize gold intercalated in the walls of mesoporous materials (GMS), which is confirmed to possess a mesoporous matrix with gold intercalated in the walls imparting great stability and recyclability.

סינתזה וביצועי קטליטי של הזהב intercalated בחומות של mesoporous סיליקה

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties ...

Chemistry

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Neonatal hypoxia ischemia is characterized by inadequate blood perfusion of a tissue or a systemic lack of oxygen. This condition is thought to cause/exacerbate well documented neonatal disorders including neurological impairment 1-3. Decreased adenosine triphosphate production occurs due to a lack of oxidative phosphorylation. To compensate for this energy deprived state molecules containing high energy phosphate bonds are degraded 2. This leads to increased levels of adenosine which is subsequently degraded to inosine, hypoxanthine, xanthine, and finally to uric acid. The final two steps in this degradation process are performed by xanthine oxidoreductase. This enzyme exists in the form of xanthine dehydrogenase under normoxic conditions but is converted to xanthine oxidase (XO) under hypoxia-reperfusion circumstances 4, 5. Unlike xanthine dehydrogenase, XO generates hydrogen peroxide as a byproduct of purine degradation 4, 6. This hydrogen peroxide in combination with other reactive oxygen species (ROS) produced during hypoxia, oxidizes uric acid to form allantoin and reacts with lipid membranes to generate malondialdehyde (MDA) 7-9. Most mammals, humans exempted, possess the enzyme uricase, which converts uric acid to allantoin. In humans, however, allantoin can only be formed by ROS-mediated oxidation of uric acid. Because of this, allantoin is considered to be a marker of oxidative stress in humans, but not in the mammals that have uricase.
We describe methods employing high pressure liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography mass spectrometry (GCMS) to measure biochemical markers of neonatal hypoxia ischemia. Human blood is used for most tests. Animal blood may also be used while recognizing the potential for uricase-generated allantoin. Purine metabolites were linked to hypoxia as early as 1963 and the reliability of hypoxanthine, xanthine, and uric acid as biochemical indicators of neonatal hypoxia was validated by several investigators 10-13. The HPLC method used for the quantification of purine compounds is fast, reliable, and reproducible. The GC/MS method used for the quantification of allantoin, a relatively new marker of oxidative stress, was adapted from Gruber et al 7. This method avoids certain artifacts and requires low volumes of sample. Methods used for synthesis of MMDA were described elsewhere 14, 15. GC/MS based quantification of MDA was adapted from Paroni et al. and Cighetti et al. 16, 17. Xanthine oxidase activity was measured by HPLC by quantifying the conversion of pterin to isoxanthopterin 18. This approach proved to be sufficiently sensitive and reproducible.

A method is described to measure biochemical markers of neonatal hypoxia-ischemia. The approach utilizes high pressure liquid chromatography (HPLC) and Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC/MS).

מדידה ביוכימית של היפוקסיה ילודים

Neonatal hypoxia ischemia is characterized by inadequate blood perfusion of a tissue or a systemic lack of oxygen. This condition is thought to ...

Medicine

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Biochemistry

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Immunology and Infection

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

Bioengineering

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The use of experimental animal models of iron overload or deficiency has been instrumental to advance knowledge of the mechanisms involved in the systemic and cellular regulation of iron homeostasis. The measurement of total iron levels in animal tissues is commonly performed with atomic absorption spectroscopy or with a colorimetric assay based on the reaction of non-heme iron with a bathophenanthroline reagent. For many years, the colorimetric assay has been used for the measurement of the non-heme iron content in a wide range of animal tissues. Unlike atomic absorption spectroscopy, it excludes the contribution of heme iron derived from hemoglobin contained in red blood cells. Moreover, it does not require sophisticated analytical skills or highly expensive equipment, and can thus be easily implemented in most laboratories. Finally, the colorimetric assay can be either cuvette-based or adapted to a microplate format, allowing higher sample throughput. The present work provides a well-established protocol that is suited for the detection of alterations in tissue iron levels in a variety of experimental animal models of iron overload or iron deficiency.

Here, a protocol for the measurement of the non-heme iron content in animal tissues is provided, using a simple, well-established colorimetric assay that can be easily implemented in most laboratories.

מדידה של תוכן ברזל רקמות שאינן Heme באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

עכבר מוח Histone שינוי כימות באמצעות ציטומטריה זרימה

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

מחבר זרקור: שיפורים במחקר בקרת ביטוי גנים

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Summary

Explore More Videos

סינתזה וביצועי קטליטי של הזהב intercalated בחומות של mesoporous סיליקה

מדידה ביוכימית של היפוקסיה ילודים

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים

מדידה של תוכן ברזל רקמות שאינן Heme באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר