שורות תאי HCC4017 וHBEC30KT נמסרו באדיבות על ידי המעבדה של ד&quot;ר ג&#39;ון מינה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות ססיל ה &#39;ואידה הירוקה לד&quot;ר לי ג&#39;אנג.

זהירות: בעת שעבדה עם רדיואקטיביות, לנקוט באמצעי זהירות מתאימה כדי למנוע זיהום של הנסיין והסביבה. השלך את כל הפסולת הבאה הנחיות בטיחות קרינה מקומיות. 1. הכנת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בצלחות 3.5 סנטימטר כך שconfluency מגיע 80% -90% ביום assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב שזריעת confluency לתאים תלויה בסוג התא וקצב הצמיחה שלהם. כאשר טיפול בתאים עם מגיב למספר מסוים של ימים, תאי זרע, כך שconfluency הוא 80% -90% ביום מדידת heme. אם מספר התאים המתקבלים מצלחות 3.5 סנטימטר אינו מספיק, השתמש 6 צלחות סנטימטר עם אותה הכמות של ALA רדיואקטיבי כמו בשלב הבא. הערה: שימוש בצלחות אישיות מומלצת כי זה קל יותר לטפל צלחות בודדות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני מדידת heme, להוסיף .1-0.3 μCi [14 C] 5-עלא וALA הקר להגיע ג סופיoncentration של 20 מיקרומטר של ALA המוחלט לכל מנה תרבות באזור העבודה מתאימה לעבודה עם חומרים רדיואקטיביים ולשים את הצלחות בחזרה לתוך החממה. באופן אידיאלי, דגירה עם ALA רדיואקטיבי במשך 16 שעות. הערה: radiolabeled 5-ALA הנדרש עשויים להשתנות בין שורות תאים. ספירה רדיואקטיביים לדקה (CPM) של לפחות 100 נדרש כדי למזער את השגיאה הקשורות לספירה. מומלץ לקבוע סכום מינימאלי של [14 C] 5-ALA נדרש לשורות תאים תחת מחקר. עבור רוב הניסויים .1-0.3 μCi מספיק כדי לקבל מדידה טובה. תוספת של ALA הקר היא אופציונלית. </li></ol> 2. הרן הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים תרבית תאים על קרח ולקחת אותם לאזור כשיר לעבודת רדיואקטיביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל ההפקה ותהליך אידוי במכסת מנוע חסין פיצוץ. בגלל האתר מאוחסן יכול להתפוצץ, להשתמש באתר בבקבוקים קטנים ולהתאדות כל נוזלים שנותרו, לא שומר את אתר בבקבוק פתוח יותר מאחד בחודש. אין להשתמש באצטון ליד להבות ומחממים פתוחים כפי שהוא דליק מאוד. אצטון חנות המכיל חומרים כימיים בבקבוקי זכוכית כפי שהוא מתמוסס פלסטיק בתרבית רקמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום באמצעות פיפטה. לשטוף את תאים פעם אחת עם 1 מיליליטר של PBS הקר 1x. לשאוב את PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של PBS הקר 1x לצלחות ולאסוף את התאים בחלק התחתון של הצלחת באמצעות שוטר גומי. להעביר את התאים שנאספו מכל צלחת לצינור מיליליטר 2 טרום צוננים שכותרת. לאסוף את כל התאים במ&quot;ל 2 צינורות. הערה: השתמש שוטר גומי טרי לכל צלחת לגירוד תאים מכל צלחת. לכל צלחת היית דורש ארבעה 2 מיליליטר צינורות, צינור 1.5 מיליליטר ובקבוקון נצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב15,000 XG דקות 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את PBS באמצעות פיפטה, לתת ספין קצר ולהסיר את PBS השייר. תאים גלולים בשל 1x PBS 100 μl. מערבולת כדי resuspend תאים ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 ו956 #; l מהשלב 5 ולהעביר צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולאחסן על קרח למדוד ריכוז חלבון. הערה: מאגר תמוגה תא יש להוסיף לתאים ושמר על קרח כדי למדוד ריכוז חלבון מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 90 μl שנותר מהשלב 5 בXG 5000 למשך 30 שניות ב 4 ° C; להסיר PBS באמצעות קצה פיפטה 200 μl לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 300 μl של חיץ חילוץ heme (ראה חומרי רשימה) על צינור אחד. אז מערבולת במשך 15 שניות כדי לערבב ולשים על קרח דק 1, לחזור על זה 3 פעמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ מיצוי heme (HEB) ומערבולת הצינור במהירות לresuspend גלולה, לעשות רק אחד או שני צינורות בזמן, כי גלולה צריכה להיות resuspended במהירות מבלי שהשאיר בHEB במשך זמן רב מדי. ברגע שHEB מתווסף לכל הצינורות וגלולים הוא resuspended לאחר מכן בצע את מערבולת 15 שניות ודקות 1 במחזור הקרח כמו בשלב הערה 8. שגלולה לא יכולה ללכת לגמרי לHEB אם גלולה נותרת במאגר HEB ל עודזמן ולא resuspended במהירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.2 מיליליטר של אתר diethyl על צינור אחד ומערבולת למשך 30 שניות. ספין ב15,000 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הערה: דיאתיל אתר נגמר טיפים פיפטה במהירות. כדי לשלוט בזה, אתר את diethyl פיפטה ולמטה פעם או פעמיים, בכך אעזור להחזיק את אתר diethyl בפיפטה. חזור על כל פעם שזה קצה פיפטה טרי משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר עליון שלב (אתר) עם פיפטה 1 מיליליטר לצינור microcentrifuge חדש. הוסף 0.5 מיליליטר של 2 N HCl, מערבולת לערבב וספין כמו בשלב 9. הערה: קשה לראות את ההפרדה בין שלבים ואתר HCl. לכן, להוסיף כמויות קטנות של Trypan כחול בפתרון 2 N HCl לשימוש במהלך הניסוי, מספיק כדי לתת לו צבע כחול חיוור. זה יעזור לי להבחין בין שני השלבים. השלב נמוך יותר יהיה כחול והשלב העליון האתר יהיה חסר צבע. מעבירים את שלב האתר חסר צבע העליון לצינור חדש וזורקים את השלב הנמוך HCl (הכחול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 10 שנייותר פעמים כדי לשטוף את שלב האתר עם 2 N HCl. מעבירים את השלב העליון האתר רק לצינור חדש במהלך כל חזרה וזורקים את שלב HCl נמוך יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף השלישי עם HCl, להעביר את השלב העליון עם פיפטה 1 מיליליטר לבקבוקון נצנץ. ייבש את הדגימות על ידי מתאדה אתר diethyl על ידי שמירה על הדגימות בO מכסה המנוע הכימי / N. </li></ol> 3. מדידה של רדיואקטיביות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להוסיף 5 מיליליטר של נוזל נצנץ לדגימות מיובשות מצעד 2.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער היטב כדי לערבב. מדוד את הרדיואקטיביות באמצעות מונה נצנץ. </li></ol> 4. חישובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים מצעד 2.6 באמצעות כמויות שווה של חיץ CelLytic M (ראו חומרי רשימה) וספין על 14,000 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של supernatant ולמדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת assay חלבון BCA. הסכום כולל של חלבון במ&quot;ג (TP) = (90 μl קונצרט כלשהו *. של חלבון ב81; ז / μl) / 1000 רמת heme סינתזה (רדיואקטיביות / TP) = pmol / מ&quot;ג של חלבון. </li></ol>

יש לנו מה למסור.

Heme ממלא תפקיד מרכזי בדור של אנרגיה תאית באמצעות נשימה 26. חילוף החומרים heme שינה ידוע להיות קשורים למחלות שונות, כוללים סרטן 28,41. עיכוב של סינתזת heme ידוע כגורם לעצירת מחזור התא ואפופטוזיס בתאי הלה 26,41. הוכח שרמת סינתזה הגבוהה heme קשור ההתקדמות של תאי סרט?...

Heme, קומפלקס של ברזל ברזלי ותשיעי protoporphyrin הוא מולקולה מרכזית להובלה וניצול חמצן באורגניזמים כמעט כל חיים 1-3. המבנה הייחודי של heme מאפשר לו לתפקד כנשא של גזים ואלקטרונים דו אטומיים, כמו גם לבצע פעולות שונות אחרות 1-5. לדוגמא, heme נקשר לחמצן בהמוגלובין ומיוגלובין להעברה והאחסון של 6,7 חמצן. זה עובד גם כמוביל אלקטרון בcytochromes במהלך נשימה ומשמש כתורם אלקטרונים לתגובות חמצון-חיזור מזורזות על ידי אנזימי ציטוכרום P450 8,9. אחת התכונות החשובות ביותר של heme הוא ש, הוא יכול לשחק תפקידי פיקוח בתהליכים תאיים ומולקולריים כגון שעתוק הגנים, סינתזת חלבון ומייקרו-רנ&quot;א biogenesis 4. לדוגמא, זה משפיע על השעתוק של גנים רבים על ידי שליטה על הפעילות של מדכאי תעתיק יונקים Bach1 וrec הגרעיני היונקיםeptor Rev-erbα 10-15. Heme מסדיר את הפעלת חלבון activator heme (האפ) 1 אשר ממלא תפקיד חשוב בהפעלה של גני המעורבים בנשימה ושליטה נזק חמצוני, בתגובה לheme או חמצן 16. Heme גם מסדיר שעתוק הגנים בתאים עצביים באמצעות גורם גדילה עצבית (NGF) איתות 3,17-20. זה גם מסדיר את סינתזת חלבון בתאי יונקים erythroid על ידי ויסות הפעילות של קינאז מוסדר heme eIF2α (HRI) 21-24. יתר על כן, heme משפיע על פעילותם של חלבוני איתות מפתח כגון טירוזין קינאז Jak2 וSrc, שהם חיוניים לתפקוד תאים תקין ו4,20,25 צמיחת תאים. נמצא כי בהלה עיכוב heme תאים גורם לעצירת מחזור התא והפעלה של סמנים הקשורים להזדקנות ומות תאים מתוכן 26. שני חסר הרן או הרמות הגבוהות של heme המשויכות השפעות בריאותיות חמורות בבני אדם 27. מולקולרי האחרוןND מחקרים אפידמיולוגיים הראו קשר חיובי של צריכת heme גבוהה וסיכון מוגבר למחלות, כגון סוכרת מסוג 2, מחלת לב כלילית וכמה סוגי סרטן, כולל סרטן הריאות, סרטן מעי גס וסרטן לבלב 27,28. בעזרת זוג תואם של המעבדה של המחברים תאי ריאה נורמלים והסרטן מצאו כי תאים סרטניים רמות גבוהות של צריכת חמצן, סינתזת heme וחלבונים המעורבים בספיגת heme וחמצן ניצול 28. מעניין לציין, עיכוב של סינתזת heme ירידה בצריכת חמצן, התפשטות, היווצרות הגירה ומושבה של תאים סרטניים 28. לפיכך, התנודות ברמות של heme אנדוגני ממלא תפקיד חשוב בויסות תהליכים מולקולריים ותאיים 3,4,28,29. ביונקים, ביוסינתזה של heme מתרחשת בשמונה שלבים, הכולל אנזימים הממוקמים במיטוכונדריה וcytosol 4 (איור 1). biosyn hemeתזה מתחילה במטריצה ​​של המיטוכונדריה עם העיבוי של גליצין וsuccinyl-CoA ליצירת חומצת 5-aminolevulinic (5-ALA), מזורז על ידי synthase ALA (אבוי) 4,31. זהו שיעור הגבלת צעד בביוסינתזה heme בתאי nonerythroid. 5-ALA לאחר מכן ייצא לcytosol בי ארבעה הצעדים הבאים להתרחש כדי ליצור coproporphyrinogen III (CPgenIII), אשר לאחר מכן מיובא חזרה למיטוכונדריה, שבו הוא הופך לIX protoporphyrin (PPIX). לבסוף, מולקולה אחת של ברזל משולב לIX protoporphyrin (PPIX) לייצר heme, תגובה מזורזת על ידי ferrochelatase (FECH) 2,4. רמת ביוסינתזה heme תלויה בעיקר ברמה של אנזים אבוי שנתונה לפיקוח הדוקה על ידי ברזל וheme 4 תאיים. ביוסינתזה של heme יכולה להיות מושפעת מפגמים גנטיים, זמינות של מינרלים מסוימים וויטמינים (למשל, ריבופלאבין, אבץ), חשיפה לרעלים (למשל, אלומיניום, עופרת), אנוקסיה, חום, ורמות של סטרואידים מסוימים (לדוגמא, אסטרוגן) 32-35. רמת סינתזת heme משתנה בתנאים חולים שונים. ביוסינתזה heme ירד יכולה לגרום לאנמיה, כמו גם מחלות נוירולוגיות 3,36. לחלופין, ביוסינתזה heme המוגברת ממלאת תפקיד חשוב בהתקדמות של סרטן מסוים 28,37. Heme הוכח להיות קריטי לצמיחה, הבידול וההישרדות של שומן יונקים, erythroid ותאים עצביים 4,38-41. לדוגמא, מחסור heme מוביל לנזק neurite בנוירונים בקליפת המוח עכבר העיקרי באמצעות העיכוב של גלוטמט NMDA (N -methyl-D-aspartate) קולטן 17. בנוסף, עיכוב של סינתזת heme גורם למות תאים מתוכנת בקרצינומה של צוואר רחם אפיתל אדם תאי הלה 26,41. לכן, מדידת רמות ביוסינתזה heme בתאים שונים בתנאים שונים חשובה ללימוד אטיולוגיה וprogressiבמחלות רבות. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ורגישה למדידת הרמה של סינתזת heme תאית באמצעות חומצת 5-aminolevulic [4 14 C]. זוהי שיטה חלופית לשיטות אחרות באמצעות 55 או 59 Fe Fe. אנחנו מעדיפים להשתמש 14 C כי הקרינה שלה היא חלשה מאוד. לעומת זאת, הגנה חזקה נדרשת לעבודה עם איזוטופים פה. יתר על כן, בשיטה זו נועדה למדוד ולהשוות סינתזת heme בתאים שונים במקביל באופן מהיר. על מנת למדוד את רמות heme מוחלטות, ניתן להשתמש בשיטה שהוקמה בעבר בתחום השימוש בHPLC 42,43.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme משמש כקבוצה התותבת למגוון רחב של חלבונים המכונים hemoproteins, כגון המוגלובין, מיוגלובין וcytochromes. הוא מעורב בתהליכים מולקולריים ותאיים שונים כגון שעתוק הגנים, תרגום, התמיינות תאים וחלוקה של תאים. רמות ביוסינתזה של heme להשתנות על פני רקמות שונות וסוגי תאים ומשתנות בתנאים חולים כגון אנמיה, נוירופתיה וסרטן. טכניקה זו משתמשת [4 14 C] חומצת 5-aminolevulinic ([14 C] 5-ALA), אחד מהמבשרים המוקדמים במסלול ביוסינתזה heme כדי למדוד את הרמות של סינתזת heme בתאי יונקים. assay זה כרוך דגירה של תאים עם [14 C] 5-עלא ואחרי חילוץ של heme ומדידה של הרדיואקטיביות שולבה heme. הליך זה הוא מדויק ומהיר. שיטה זו מודדת את הרמות היחסית של ביוסינתזה heme ולא מוחלט תוכן heme. כדי להדגים את השימוש בtechn זהique הרמות של ביוסינתזה heme נמדדו בכמה שורות תאי יונקים.

שיטה זו משמשת להשוואת הרמות של סינתזת heme בנורמלי (HBEC30KT) לעומת סרטן תאים (HCC4017) ריאות. איור 2 מראה על רמה גבוהה יותר של סינתזת heme בתאי סרטן (HCC4017) מאשר בתאים רגילים ריאות (HBEC30KT). רמת סינתזת heme נמדדה גם בתאים נורמלים וסרטניים בנוכחות ציאניד קרבוניל uncoupler 3-chlorophenylhydrazo...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells at JoVE.com

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

measurement-of-heme-synthesis-levels-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Video: Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

הדמיה של פליטת אור upregulation הרן-1 Oxygenase בנוהל גואה שא

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.