הכתמת מוחות אימונו-היסטוכימית של מוחות עכברים היא טכניקה נפוצה במחקר מדעי המוח. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של תוצאות היסטולוגיה במוח עשויות להשתנות בין חוקרים ומעבדות שונות. אנו מציגים מתודולוגיה מבוססת למחקרים היסתולוגיים של מוחות עכברים שהוכחו כניתנים לשחזור, אמינים ויעילים.
עוזר להדגים את ההליך יהיה ד"ר Chunmei וואנג, פרופסור עוזר מהמעבדה שלי לאחר אישור המרדים מוצלחת שמונה עד 16 שבועות C57 שחור / 6J עכבר, לתקן את העכבר על לוח קצף ולעשות קיסך שטחי אורך לאורך קו האמצע מעל בית החזה והבטן, ולאחר מכן להזיז את העור הצידה כדי לחשוף את דופן השריר של בית החזה והבטן. לאחר מכן, לעשות נתק בשכבת השריר כדי לחשוף את הכבד ואת המעי. לאחר מכן, באמצעות מספריים, לחתוך את בית החזה כדי לפתוח את בית החזה ולחשוף את הלב והריאות.
באמצעות מלקחיים hemostatic, למשוך את בית החזה הצידה כדי להרחיב את אזור העבודה. הבא. כדי למקם צינורית זלוף, לחדור ישירות את חדר הלב השמאלי עם צינורית קהה ולהכניס אותו בזהירות לתוך ביש"ט עולה. מניחים סיכות סביב השילוב של הצינורית וצינורות מצמידים על לוח הקצף כדי לתקן את הצינורית במקום במהלך זלוף, ולהמשיך לחתוך את האטריום הנכון כדי לאפשר את זרימת הדם מהמחזור.
עבור זלוף עם תמיסת מלח, להפעיל את מתג לחץ מלוחים ולפרוט את העכבר עירוי עם 40 עד 60 מיליליטר של מלוחים. שימו לב לזרימה מהאטריום הימני ולצבע הכבד מקרוב. לאחר מכן, כדי לטבול עם פורמלין, לכבות את מתג לחץ מלוחים ולהדליק את מתג הלחץ פורמלין כדי לחדיר את העכבר עם 40 מיליליטר של 10% פורמלין ניטרלי חוצץ.
התבונן בגפיים של החיה לראיות לרעידות. לבידוד המוח, השתמש במספריים כדי להסיר את הראש ולבצע חתך בקו האמצעי לאורך החתך כדי לחשוף את הגולגולת, ואז לקצץ את העור ואת ההתקשרות עם השריר. לאחר מכן, לעשות לחתוך ברכס מסלולית ומניחים את הקצה החד של מספריים קשתית לתוך מגנום foramen.
לקדם את המספריים לאורך פני השטח הפנימיים של הגולגולת, שמירה על לחץ כלפי מעלה כדי למנוע נזק למוח. לאחר מכן, הסר בזהירות את העצמות הקודקודיות והחזיתיות וקרום המוח לפני הסרת המוח מהגולגולת הפתוחה. מניחים קרח יבש על גבי צלחת התאמת הגובה של מיקרוטומיה הזזה ולחכות עד כפור לבן גלוי, ולאחר מכן בזהירות להפיץ חמישה מיליליטר של 30% סוכרוז על גבי הצלחת כדי ליצור שכבת בסיס מוצקה לאחר סוכרוז קפא.
לאחר מכן, מקם את כל דגימות המוח אופקית בשורה על גבי בסיס סוכרוז עם 500 מיקרוליטרים של 30%סוכרוז. לאחר חמש עד 10 דקות של הקפאה, כאשר המוח הפך קשה ולבן, לקצץ את המוח עד השכבה או האזור הרצוי הוא הגיע, ולאחר מכן, לעבור ממצב חיתוך למצב ההזנה ורקמת המוח סעיף כדי ליצור קטעים בעובי 25 מיקרומטר. לאחר מכן, הכינו צלחת 48 באר מלאה PBS ולסמן חמש בארות למוח עכבר אחד.
באמצעות מברשת צבע, לאסוף קטע אחד ולהניח אותו לתוך באר אחת, ולאחר מכן לאסוף את החלק הבא של אותו עכבר ומניחים אותו לתוך הבאר השנייה. חזור על ההליך עד שהבאר החמישית תגיע להציב את סעיפים 6 עד 10 בבאר הראשונה עד החמישית, וכן הלאה. מניחים מסננת תאים לתוך באר אחת של צלחת תרבית תאים של ששת בארות מלאה PBS, באמצעות מברשת צבע, להעביר סדרה אחת של מקטעי מוח לתוך מסננת התא.
לשטוף את החלקים האלה PBS על ידי העברת מסננת התא אחר מלא PBS על שייקר. לאחר מכן, להעביר את מקטעי המוח מן מסננת התא לתוך צינור 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של WFA תווית ביוטין ודגרה על פלטפורמת נדנדה ב 50 סל"ד לילה. למחרת, לשטוף את קטעי המוח עם PBS כפי שהוכח בעבר, ולאחר מכן להעביר את החלקים לתוך צינור המכיל מיליליטר אחד של פתרון סטרפטאבידין-אור יום 488 ודגרה במשך שעתיים על פלטפורמת נדנדה.
לאחר שטיפה של חלקי המוח עם PBS שוב, לדגור אותם חוצץ חסימה במשך שעתיים, ואחריו דגירה בנוגדן העיקרי לילה על פלטפורמת נדנדה. למחרת, לאחר שטיפות PBS, לדגור את החלקים בנוגדן משני במשך שעתיים. מלא שתי מנות פטרי עם 100 מיליליטר של PBS ולהעביר את כל חלקי המוח מסננת אחת לתוך המנה הראשונה.
יישר את מקטעי המוח בסדר נוירואנטומי מ caudal ל rostral. לאחר מכן, הטביעו שקופית אחת לתוך המנה השנייה כשקצה אחד מוטה מעט במעמד, ובאמצעות מברשת צבע עדינה, הניחו בעדינות מקטע מוח ממש מתחת לממשק חיץ האוויר על המגלשה המוטה. לאחר מכן, באמצעות pipette העברה, לאט ובעדינות להסיר את המאגר כדי להוריד את רמתו עד החלק המוח הוא לחלוטין מעל ממשק חיץ האוויר.
המשך לחזור על תהליך זה עד להגעה לתחתית השקופית וכל המקטעים נטענים על השקופית. להדמיה, הפעל את הסורק והמחשב ולאחר מכן מקם את השקופיות במחזיק השקופית עם התקן הטעינה והכנס את המחזיק לסורק. פתח את התוכנה עבור הסורק ובחר את מיקום האחסון ופרופיל הסריקה המתאימים.
התחל את סריקת התצוגה המקדימה על-ידי לחיצה על לחצן התחל סריקה מקדימה. לאחר הסריקה, פתח את אשף זיהוי הרקמות והקף את אזורי העניין להדמיה. לאחר בחירת האזורים להדמיה, לחץ על לחצן התחל סריקה והמתן עד שהמכונה תסיים את הסריקה.
בדוק את קובץ התוצאה וייצוא התמונות. מוצגות כאן תמונות פלואורסצנטיות מייצגות אימונו-היסטוכימיה של מקטעי מוח עכבר קורונלי ב Bregma-מינוס 0.82 מילימטרים, המציגים את ההפצה של ויסטריה פלוריבונדה אגלוטינין, ארגינין וזופרסין ו- DAPI. ויסטריה floribunda agglutinin אותות נצפים באזור perifornical של ההיפותלמוס הזעיר גרעין הרשתית, ואילו אותות ארגינין וזופרסין נצפים בגרעין paraventricular.
כאשר מנסים פרוטוקול זה בפעם הראשונה, אנו מציעים לבצע אותו תחת פיקוחו של חוקר מנוסה. הפרוטוקול יסייע בהפקת תוצאות היסתולוגיות אופטימליות ועקביות בקרב חוקרים ומעבדות שונות, וישמש התייחסות למתחילים הלומדים טכניקה זו.
