Name: transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses
Uploaded: 2020-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
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この作品は、フィンランドアカデミー[315948、314387からN.K.への]からの助成金によって支えられ、;シグリッド・ジュセリウス財団[N.K.、J.T.へ]。エミール・アールトネン財団[J.-A.M.、T.L.へ]。トゥルク分子医学博士課程[S.C.-M.、O.O.O.]。

実験用マウスおよびすべての動物実験の維持は、トゥルク大学の実験動物のケアと使用に関する関連するガイドラインと規則に従って行われました。
1. 微小解剖のための半細管の調製
<ol><li>CO2窒息、子宮頸部脱臼を経て、成人男性マウス(生後8週≥、精巣は80~120mg)をCO2 窒息で犠牲にします。 注:マウスは性的に成熟し、できれば少なくとも8週は生まれでなければなりません。若年マウスのトランスイルミネーションパターンは、半日本上皮の波がまだ完全に確立されていないため成人とは異なり、そして精子形成の第1波のタイミングは21,22と異なる。<4週齢の雄マウスにおける長期精子の欠如は、トランスイルミネーション支援微小解剖への使用を妨げる。正常な精子形成を有するすべてのマウス株を使用することができる。</li>
	<li>腹側腹部に70%エタノールを吹き付けます。無菌はさみを使用して腹部腔を開き、V字型の開口部を作ります。</li>
	<li>滅菌鉗子で精巣上脂肪パッドを引っ張り、精巣を見つけ、はさみを使って解剖し、PBSを含む無菌100mmペトリ皿の上に置きます。 注:無菌性を維持するために、すべてのラボウェアと外科用ツールが無菌であることを確認してください。</li>
	<li>細かい先端のはさみを使用して、テニの膜を覆う厚い繊維状シートである チュニカ・アルブギネアでスリットを切断して精巣を脱カプセル化する。その後、鉗子のペアを使用して開いたチュニカを引き裂きます。鉗子で押して管を強制的に外に出し、チュニカを捨てます。 注意:チュニカを捨てる間、 動脈精巣 がチュニカと一緒に取り除かれるのは、いくつかの下流のアプリケーションにとって有益かもしれません。半細管を損傷しないようにします。</li>
	<li>新しいペトリ皿に半細管を移動し、ペトリ皿の底をカバーするのに十分な無菌PBSを注ぎます。次に、細管をそっと引き離しますが、細管を損傷しないようにします。 注: 機械的なストレスが多すぎると、トランスイルミネーション パターンに影響を与え、組織とその細胞アーキテクチャの実行可能性に影響を与えます。また、この管は、ステージング(3B)なしでこの時点から全実装免疫染色のために処理することもできる。SALL4、c-KITおよびDNMT3A18,23のような分化した精子で発現されるタンパク質に対する抗体を含めることによって、遡及的にステージを定義するだけで十分である場合がある。精子の密度は比較的信頼性の高いステージ指標である(図2)。</li>
</ol>2. トランスイルミネーション支援マイクロディシス
<ol><li>ペトリ皿をステージにテーピングして解剖顕微鏡の下にしっかりと置きます。 注:ペトリ皿をよくテープで留めて、収集した段階的な半細管セグメントの混合を引き起こす可能性のある動きを防ぐことが重要です。</li>
	<li>焦点下の半細管の光吸収パターンを明らかにするために、サンプルが下から照らされ、光がサンプルを通過することを確認してください。 すなわち、それはトランスライトされます。 注:吸収/散乱光の量は、細長い精子の凝縮のレベルに対して相対的であり、半細管内のそれらの束縛:より凝縮され、より多くの光が吸収され、 すなわち、より暗く見える。</li>
	<li>図2、図5A、図S1で説明した異なる段階の光吸収パターンを、細管の束を細切りで慎重に移動させることで、よく知ることができます。 注:段階は常に論理的な順序で互いに従い、半会体上皮の波を形成します。しかし、精子波の方向が時々逆転し、再び戻ってくる(モジュレーション4、9とも呼ばれる)、時には手順を複雑にすることを知ることが重要です。また、各段階の長さは、細管のmm数という点で、かなり異なる。</li>
	<li>注意深くフックチップで鉗子を使用して目的の管管を持ち上げ、マイクロディションハサミを使用して適切な長さのセグメントを切断します( 補足ビデオ1を参照)。鉗子の先端のフックは管管を持ち上げて持ち上げることを容易にし、それを絞るのを避けるのを助ける。 注: 切り取るセグメントの長さは、ダウンストリーム のアプリケーションによって異なります。タンパク質またはRNA解析用の特定の段階のプールされた細管片のコレクション12、13(II-V、VII-VIIIおよびIX-XI、図5B)の長さは、典型的には2〜5mmです。標準的なフェノール-クロロホルム抽出が使用される場合、約200ngのRNAは1mmの尿細管から導出され得る。ステージされたチューブセグメントの全体マウント染色の場合、セグメントの長さは>5 mmでなければなりません。スカッシュの準備の場合、セグメントの中央のセルが長すぎると終了できなくなる可能性があるため、セグメントの長さが 1 ~ 2 mm を超えないようにしてください。小管長の正確な測定のためにペトリ皿の下にmmスケールを使用してください。</li>
</ol>3. 異なる製剤の免疫染色
<ol><li>スカッシュ調製:ステージ検証および免疫染色 注:ステージ特異的な細管片は、フェーズコントラスト顕微鏡とその後の免疫染色によって生きている細胞の形態学的分析を行うためにカバーガラスと顕微鏡スライド上で押しつぶすことができます。トランスイルミネーション支援マイクロディセクショネ法に慣れた段階を検証するには、このアプローチを使用することをお勧めします。<ol>
<li>ピペットを使用して10 μLの体積でセグメントを収集し、顕微鏡スライドに移動します。</li>
		<li>カバーガラス(20mm x 20mm)を慎重にチューブに置いて、細管を押しつぶします。その結果、細胞は細管から流れ出て、生細胞単層を形成する。カバーガラスの端にフィルターペーパーを置き、細胞の広がりを容易にします。細胞を押しつぶしすぎて生き続けないようにしてください。</li>
		<li>顕微鏡下で広がる細胞を監視しなさい。40x目的で位相差顕微鏡を用いて、存在する細胞の種類を調べることによってステージ認識を検証する(図2、図S2)。</li>
		<li>細胞が広がって細管の両端から丸い単層を形成したら、滑り台を鉗子で保持しながら液体窒素を含む容器に浸します。10 sのために水没し続けてください。または、凍結のためのドライアイスプレートの上にスライドを置きます。</li>
		<li>カバーガラスをメスでひっくり返して取り外します。</li>
		<li>遅れることなく、固定を進め、2〜5分間90%エタノールの容器にスライドを素早く入れます。 注:スカッシュの準備が90%エタノールに置く前に解凍しないことを確認してください。他の固定剤は、アセトンなどの10分間使用することもできる。</li>
		<li>空気乾燥し、室温(RT)(いくつかの日まで)または-80 °C(長期)で保存します。</li>
		<li>免疫染色の場合、RTで10分間、4%パラホルムアルデヒド(PFA)でサンプルを後固定します。</li>
		<li>PBSでリンスし、0.1%トリトンX-100でPBSで5分間透過させます。</li>
		<li>PBSですすいで、各スカッシュサンプルの周りにグリースリングを描きます。</li>
		<li>50~100 μLの10%BSA(牛血清アルブミン)をPBSの0.1%Tween(PBST)に加え、RTで30分間サンプルをブロックします。</li>
		<li>BSA溶液を取り出し、一次抗体をPBSTで10%のBSAで希釈し、RTで1時間インキュベートします。</li>
		<li>PBSTで5分間3倍洗います。</li>
		<li>PBSTで10%BSAに希釈した二次抗体を用いてインキュベートする。 注:アクロソームを染色するために、サンプルは、特定の一次および二次抗体の代わりに、10%のPBSTで10%BSAのローダミン標識ピーナッツ凝集剤抗体(PNA、1:1:1000)でインキュベートすることができます(図S3)。</li>
		<li>PBSTで5分間3倍洗い、PBSで洗い流し、DAPIを含むマウント剤でマウントします。</li>
	</ol></li>
	<li>半細管の全実装免疫染色 注: 以下のプロトコルは、(ステップ 2.4 から)管状セグメントの全体マウント染色について説明します。研究者がステージングなしで全体マウント染色を実行したい場合(ステップ1.5から)、3.2.1と3.2.7のメモに注意してください。<ol>
<li>ピペットを使用して、氷冷PBSの細管セグメント(ステップ2.4から)を15 mL円錐形チューブに移し、氷の上で堆積させます。 注:1.5.から未段のチューブを使用する場合は、数回傾いた皿にピペットを上下に戻すことによって、ペトリ皿の中の管状を分離します。カットチップ付きの1mLピペットを使用してください。このステップは、組織の構造を開くことを意図しています。ただし、チューブを損傷する可能性があるため、あまり多くのピペットを避けてください。尿細管の沈降には数十秒かかります。小管状の断片、間質細胞および細胞の破片は上清にとどまる。</li>
		<li>ピペットまたは吸引器を使用して上清(SN)を慎重に除去します。氷冷PBSの10 mLを追加し、反転によって混合します。</li>
		<li>堆積物を許可し、前と同様にSNを削除します。</li>
		<li>5 mLの4%PFAを加え、+4 °Cの回転テーブル(20~30 rpm)で5時間固定します。 注: 固定時間は、関心のあるタンパク質とその細胞内局在性に依存します。核および細胞質タンパク質の場合、2時間固定は典型的には十分であるが、GFRα1(GDNFファミリー受容体α1;GDNFファミリー受容体α1のような膜マーカー; 図 6A,B) は、最大 6 時間の長い固定の恩恵を受けます。</li>
		<li>堆積物を可能にし、以前のようにSN(PFA)を取り除き、PBSの10 mLを加えてチューブを反転させることによって短時間すすいだ。</li>
		<li>堆積物を可能にし、以前のようにSNを取り除き、+4°Cの回転テーブルでそれぞれ少なくとも10分間PBS洗浄工程を3回繰り返し、+4°Cで染色または保存を進めます。 注:作業条件が無菌で清潔であれば、サンプルを保管して少なくとも数週間使用することができます。また、2%のストック溶液から0.02%(w/v)の最終濃度にアジドナトリウムを加え、+4°Cで保存する前に細管を保存するのに役立ちます。</li>
		<li>1 mL ピペットを使用して、10 ~ 20 個の固定チューブセグメントを 2 mL ラウンドボトム チューブに移動します。堆積物を許可し、SNを削除します。 注:上演されていない長い管状を使用している場合は、細管をペトリ皿に注ぎ、マイクロディスセクションはさみと鉗子カットセグメントを使用して約5〜20mmです。染色手順の間に長すぎるセグメントが絡み合うのに対して、短すぎるとセグメントが失われやすくなります。</li>
		<li>PBS(PBSX)で2%BSA +10%FBS(胎児ウシ血清)を0.3%トリトンX-100に1mL加えます。RTで回転テーブル(20~30 rpm)で少なくとも1時間ブロックします。</li>
		<li>1 mLのPBSXでリンスし、ピペット処理によりSNを除去し、PBSXで1%BSAに希釈した一次抗体250μLを加えます(1:100-1:2000希釈)。RTで2時間、または回転テーブル上の+4 °Cで一晩(20〜30 rpm)インキュベートします。</li>
		<li>上記のように1mLのPBSXで細管をピペットして抗体溶液を除去します。回転テーブル(20~30 rpm)の上で、PBSXで1時間3回洗浄します。 注:この最初の洗浄の後、サンプルは必要に応じて+4 °Cで一晩放置することができます。</li>
		<li>SNを取り除き、PBSXで1%BSAで希釈した250μLの二次抗体を添加します(通常、蛍光標識抗体の希釈量は1:500)。ホイルで覆い、回転テーブル(20~30 rpm)をRTで1時間インキュベートします。</li>
		<li>3.2.10 を繰り返します。</li>
		<li>最後にSNを取り外し、細管を顕微鏡スライドに注ぎます。ゲルローディングチップを使用して、細管をリニアストリップにそっと分離して配置します。余分なバッファーを排出し、取り付け媒体とカバースリップを追加します。 注意:細管を配置しながら乾燥しないでください。DAPIを用いた核の逆染色は、ほとんどの場合必要ありません。カバースリップの端をマニキュアでシールし、サンプルの乾燥や劣化を防ぎます。スライドはイメージングの前に+4 °Cで1〜2週間保存することができます。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. 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著者らは開示するものは何もない。

上記で述べたトランスイルミネーション支援マイクロディクショクション法は、精子形成の研究のためのステージ指向のアプローチを可能にする。精子形成は高度に同期化されたプロセスであり、分化コミットメント(段階VII-VIII)、分裂(VII-VIII)の発症、突然変異分裂(XII)、精子伸び(VIII)および精子(V8)の発症など、精子異分化中のすべての重要なステップは、段階依存的な方法で調節され、実行される。ステージ指向の分析は、精子形成の特定のステップに制限され、したがって半日本体上皮周期の定義された段階でのみ発見されるこれらの特定の事象を研究するための強力なツールを提供する。この方法を習得するには、いくつかの練習が必要であり、良質の解剖顕微鏡と適切な照明条件の使用が成功の鍵です。この方法を日常のツールキットの一部として実施することは、精子形成中の分子事象のより正確な解剖を可能にすることによって、男性の生殖機能に関する研究の影響および生物学的関連性を大幅に改善する能力を有する。
我々が研究してきたすべてのWTマウス株は、同様のトランスイルミネーションパターンを示し、半日形成上皮周期の段階で保存された細胞会合を示す。生殖細胞の精子形成分化はWTマウスと大きく異ならないという条件では、我々が研究したすべてのノックアウトマウスモデルにも同じことが当てはまります。また、半日本円上皮周期7の段階の縦方向の区分配置を示す他の種にも適用することができる。ただし、非セグメント段階(ヒトなど)を持つ種は使用できません。トランスイルミネーションパターンを定義する際に、細長い精子のクロマチン縮合の本質的な役割を考えると、このプロセスのいかなる誤った調節も必然的にこの方法の実装に影響を及ぼすことが明らかである。若年マウスおよび若年成人(5-6週間)では、トランスイルミネーションパターンはまだ完全に確立されていないため、8週以上経過したマウスのみを使用する必要があります。また、細管を圧迫して引っ張ることは、半上皮内の細胞アーキテクチャを歪めるため、必然的にトランスイルミネーションパターンに影響を与えることに留意することも重要です。
分離された半細管セグメントはまた、虚生を含む精子形成結合プロセスの ex vivo 観察および操作を可能にする培養することができる。組織の生存率を確保し、RNAおよびタンパク質の分解を防ぐために、サンプルを採取し、マウスを犠牲にしてから2時間以内に処理する必要があります。半細管の エキビボ 培養では、犠牲から培養の発症までの時間は1時間を超えてはならない。尿細管断片の完全性は、通常、適切に収穫されれば 、インビトロで 72時間まで維持することができる。
半日膜上皮周期の段階は、スカッシュ製剤16の位相対比顕微鏡を用いて検証し、さらに正確に定義することができる。顕微鏡検査は、細胞の生きた上で行われ、分析に追加の次元を提供し、精子形成28、29、30の特定段階における細胞小器官または細胞の動きを観察することを可能にする。位相対照顕微鏡は、その後の免疫染色のための正確なステージングを提供し、ステージ特異的な変化を含む精子形成中のタンパク質発現および局在性ダイナミクスの非常に詳細な分析を可能にする。
細胞はスカッシュ製剤の上皮コンテキストから放出されるが、尿細管セグメントの全実装免疫染色は、その生理学的環境における精子形成細胞の研究を可能にする。したがって、全実装製剤は、断面での免疫染色よりも、半細管アーキテクチャとその細胞間接触のより良い視覚化を提供し得る。重要なことに、免疫染色前の管状セグメントのトランスイルミネーション支援ステージングは、特定のセグメントの特定の段階に関する情報を含めることによって、アプローチをさらに強力にします。全型染色は、細管周囲筋膜細胞、骨周管マクロファージ、精子などの半細管周囲の細胞の研究に特に有用であるが、滑術細胞および心肥後性胚芽細胞に関する研究に関する新しい洞察を開く可能性がある。

男性生殖細胞の二量体精子から成熟したハプロイド精子腫への分化、すなわち、精子形成は、性的成熟した個体1の精巣における半細管の上皮において行われる複雑なプロセスである。A1精子の有糸状子は、最初に5回分裂して分化をコミットした個体群を拡大し、最終的にハプロイド精子を生じさせる精子細胞としてメイオシスに入る。円形精子の分化、すなわち、精子形成は、核圧縮および壊死体およびフラゲラムのような精子特異的構造の構築を含む細胞形態の複雑な変化を伴う。マウスでは、精子形成の全過程は、完了するまでに35日を要します2,3.
任意のロケールで、半種上皮は、分化生殖細胞の最大5コホートに生殖細胞幹細胞/前駆細胞および体細胞セルトリ細胞1を宿す。分化性生殖細胞は同心円状の層を形成し、その組成は予測可能であり、開発の所定の段階でハプロイド細胞は常に特定のタイプの精子細胞および精子4,5と関連する。したがって、管状の任意の断面は、一定の組成の生殖細胞のコホートをホストする。これらの特定の細胞会合は、半日本体上皮の段階として定義される。ステージ当たりの段階は、滞っているチェックポイントのような状態を提示しないが、同期1、2、6で胚芽細胞コホートの分化が進行するにつれて継続的に発達する。マウスでは、半細管の縦軸に沿ってセグメント状に配置された12段階(I-XII)2があり、セミニファーの上皮、または精子発生性波7、8、9の波を形成する論理的な順序で互いに従う(図1)。精子形成の完了には4サイクルかかり、任意の半細管断面内の分化性生殖細胞の階層層またはコホートは、一時的に互いに離れた半円性周期である。サイクルの長さは種に依存し、マウスでは各サイクルは8.6日10を要する。
この段階は、組織学的精巣の断面5(図1および図2)上の半上皮の細胞組成および組織に基づいて同定することができる。しかし、組織学的分析は手間がかかり、時間がかかり、固定と染色を必要とし、したがって、生きた組織に適用することはできません。重要なことに、ステージングは、異なる段階のサイクルによって示される明確な光吸収/散乱パターンを利用することによって、解剖顕微鏡下で生体組織に対しても行うことができる(図2)。各段階が光を吸収し、散乱する能力は、任意の所定のステージがホストする後期のポストマイオティック精子のクロマチン縮合のレベルとこれらの細胞の梱包をバンドル7,11に対して相対的である。精子分化、すなわち、精子形成は、さらに、円形精子の8ステップ(ステップ1〜8)および8ステップの分化(ステップ9〜16)分化を含む16の発達段階に分けられる(ステップ9〜16)分化する(図1)。ステップ 9-11 伸長精液(ステージ IX-XI)は、低レベルのクロマチン縮合のみを表示し、低量の光が吸収される。クロマチン縮合はステップ11の精子(ステージXI)から始まり、ステップ15-16伸長性の精子(ステージIV-VIII)は完全に凝縮したクロマチンを含み、したがって最大の光吸収を示す(図3)。クロマチンは、精子の頭部にしっかりと詰め込まれるには凝縮する必要があります。光吸収パターンに寄与するその他の要因は、上皮内の精液を伸長させる場所(基底対円端)および伸長性精液の束縛(II-Vの段階で発音される)11(図3)。束は、細管の真ん中のスポットとして、解剖顕微鏡の下でエッジ上のストライプとして見られ、クロマチンをより凝縮すると、スポット/ストライプ11が暗くなる。
この記事では、半日本体上皮周期の特定段階を表す半細管セグメントの分離のためのトランスイルミネーション支援マイクロ解離法の使用について説明する。一旦単離されると、段階的な細管セグメントは、生化学的RNAおよびタンパク質分析12、13、14、15、フローサイトメトリー16、エクスビボチューブ培養17および免疫染色を含む様々な下流分析を受けることができる。また、生細胞形態学的解析とその後の免疫染色のために、ステージされた細管セグメントの押しつぶされた単層を調製するための詳細な下流プロトコル、ならびに管状セグメントの全実装免疫染色を提供する。図 4で説明する一言で説明したワークフロー。
トランスイルミネーション支援マイクロディション法は、ステージの同期された細胞組成のおかげで分化の特定のステップで生殖細胞を正確に同定し、単離することを可能にする。重要なことに、それはまた、生きた組織上の精子形成中のステージ依存性事象の研究を可能にする。精子形成のためのスケーラブルなインビトロモデルの欠如を考えると、この方法はまた、ステージ特異的な尿細管セグメントex vivo12、17に対する標的短期発達および毒物学的研究を可能にするユニークな利点を有する。ここでマウスの方法を説明する一方で、同じ手順は、ラット4、7、15、19、20などの半上層の半上皮の縦方向およびセグメント配置を有する任意の哺乳類種に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>cover glass 20x20 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td>11961988</td><td></td></tr><tr><td>Falcon conical tube 15-ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>grease pen (ImmEdge)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>microscope slide Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (100-mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

精子形成は、最終的に身体の最も明確な細胞タイプの1つである精子を生み出すユニークな分化プロセスである。生殖細胞の分化は、4〜5世代の生殖細胞を同時に宿主とする細胞質セルトリ細胞の細胞質ポケットで同時に行われ、それらの発達を調整し、同期させる。したがって、断面内の生殖細胞型の組成は一定であり、これらの細胞の関連は半日本体上皮周期の段階(I-XII)としても知られている。重要なことに、ステージは、トランスイルミネーションによって明らかにされた差動光吸収/散乱特性に基づいて無傷の半細管から同定することができ、また、ステージが管状に沿って順番に続き続くという事実も示す。本稿では、マウス半離上皮周期の特定段階を表す半細管セグメントの分離のためのトランスイルミネーション支援マイクロ解離法について説明する。半細管の光吸収パターンは、まず解剖顕微鏡で検査され、次に特定の段階を表す管状のセグメントを切断し、下流の用途に使用します。ここでは、ステージ特異的スカッシュ製剤および無傷の細管セグメントに対する免疫染色プロトコルについて説明する。この方法により、研究者は精子形成の特定の段階で起こる生物学的事象に焦点を当てることができ、精子形成および基礎分子メカニズムの発達、毒物学、および細胞学的研究のためのユニークなツールを提供する。

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Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

本プロトコルは、半日本円上皮周期の特定段階を表す成体マウス半細管の断面微小切除法、およびその中の細胞タイプ、および後にスカッシュ製剤および無傷の管状セグメントの免疫染色を記述する。

下流免疫染色解析のためのマウス半離層上皮周期の特定段階のトランスイルミネーション支援解離

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

Nanyang Technological University

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7.2K ビュー.  University of Turku, Turku, Finland. 本プロトコルは、半日本円上皮周期の特定段階を表す成体マウス半細管の断面微小切除法、およびその中の細胞タイプ、および後にスカッシュ製剤および無傷の管状セグメントの免疫染色を記述する。

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

発生生物学

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. Whole mount preparations preserve the structure of meiotic nuclei, and importantly, each gonad arm contains all stages of meiosis, organized in a temporal-spatial progression that makes it easy to identify nuclei at different stages. Adult hermaphrodites have two gonad arms, each organized as a closed tube with proliferating germline stem cells at the distal closed end and cellularized oocytes at the proximal open end, which join in the center at the uterus. Dissection releases one or both gonad arms from the body cavity, allowing the entirety of meiosis to be visualized. Here, a common protocol for immunofluorescence against a protein of interest is presented, followed by DAPI staining to mark all chromosomes. Young adults are immobilized in levamisole and quickly dissected using two syringe needles. After germline extrusion, the sample is fixed before undergoing a freeze crack in liquid nitrogen, which helps permeabilize the cuticle and other tissues. The sample can then be dehydrated in ethanol, rehydrated, and incubated with primary and secondary antibodies. DAPI is added to the sample in the mounting medium, which allows reliable visualization of DNA and makes it easy to find animals to image under a fluorescent microscope. This technique is readily adopted by those familiar with handling C. elegans after a few hours spent practicing the dissection method itself. This protocol has been taught to high-schoolers and undergraduates working in a research lab and incorporated into a course-based undergraduate research experience at a liberal arts college.

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

This is a commonly used method for C. elegans gonad dissection followed by freeze crack, which produces germline samples for immunofluorescence via antibody staining, or for simple DAPI staining to visualize DNA. This protocol has been successful for undergraduates in a research lab and in a course-based undergraduate research experience.

C.エレガンス 免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

遺伝学

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

マウス血液精巣関門の整合性を研究するIn Vivo法

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of puberty - more than ten years after the establishment of systemic immune tolerance. Spermatogenic cells express a number of proteins that may be seen as non-self by the immune system. The testis must then be able to establish tolerance to these neo-antigens on the one hand but still be able to protect itself from infections and tumor development on the other hand. Therefore the testis is one of a few immune privileged sites in the body that tolerate foreign antigens without evoking a detrimental inflammatory immune response. Sertoli cells play a key role for the maintenance of this immune privileged environment of the testis and also prolong survival of cotransplanted cells in a foreign environment. Therefore primary Sertoli cells are an important tool for studying the immune privilege of the testis that cannot be easily replaced by established cell lines or other cellular models. Here we present a detailed and comprehensive protocol for the isolation of Sertoli cells - and peritubular cells if desired - from rat testes within a single day.

Primary Sertoli cells are required for studying testis-immune privilege, signal transduction during inflammation or infection, and utilization of their immunoprotective properties. Here we describe an enzyme-based protocol for the isolation of highly purified primary Sertoli cells and peritubular cells from rat testes.

ラット精巣からのセルトリ細胞と尿細管周囲細胞の単離

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

免疫・感染学

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

<meta charset="utf8"></head><body>胚発生を研究するためのマウスラウンド精子細胞注入手順

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>マウスラウンド精子細胞注射

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

マウスラウンド精子細胞注射

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

下流免疫染色解析のためのマウス半離層上皮周期の特定段階のトランスイルミネーション支援解離

要約

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この動画の章

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

精細管スカッシュマウスモデルを用いた精子の細胞学的解析法

C.エレガンス免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

マウス血液精巣関門の整合性を研究するIn Vivo法

ラット精巣からのセルトリ細胞と尿細管周囲細胞の単離

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

下流免疫染色解析のためのマウス半離層上皮周期の特定段階のトランスイルミネーション支援解離

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マウスラウンド精子細胞注射

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