Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Akademie Finnlands [315948, 314387 bis N.K.] unterstützt; Sigrid Jusélius Stiftung [nach N.K., J.T.]; Emil Aaltonen Foundation [to J.-A.M., T.L.]; Turku Doktoratsstudium molekulare Medizin [S.C.-M., O.O.].

Die Wartung von Labormäusen und alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren an der Universität Turku durchgeführt.
1. Herstellung von seminiferen Tubuli für die Mikrodissektion
<ol><li>Opfern Sie eine erwachsene männliche Maus (≥8 Wochen alt, Hoden 80–120 mg je nach Stamm und Alter) durch CO 2-Erstickung gefolgt von zervikaler Dislokation. HINWEIS: Die Maus sollte geschlechtsreif und vorzugsweise mindestens 8 Wochen alt sein. Transilluminationsmuster von jugendlichen Mäusen unterscheidet sich von Erwachsenen, weil die Welle des seminiferösen Epithels noch nicht vollständig etabliert ist, und das Timing der ersten Welle der Spermatogenese ist deutlich21,22. Der Mangel an länglichen Spermaatiden bei <4 Wochen alten männlichen Mäusen schließt ihre Verwendung für transilluminationsunterstützte Mikrodissektion aus. Alle Mausstämme, die eine normale Spermatogenese haben, können verwendet werden.</li>
	<li>Sprühen Sie den ventralen Bauch mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die abdominobeckende Kavität mit einer sterilen Schere, wodurch eine V-förmige Öffnung entsteht.</li>
	<li>Ziehen Sie das epididymale Fettpolster mit sterilen Zangen, lokalisieren Sie die Hoden, sezieren Sie sie mit einer Schere und legen Sie sie auf eine sterile 100-mm-Petrischale, die PBS enthält. HINWEIS: Um die Sterilität aufrechtzuerhalten, stellen Sie sicher, dass alle Laborwaren und chirurgischen Werkzeuge steril sind.</li>
	<li>Mit einer feingekippten Schere entkapseln Sie die Hoden, indem Sie einen Schlitz in der Tunika albugineaschneiden, dem dicken Faserblech, das die Hoden einkapselt. Dann reißen Sie die Tunika mit einem Paar Zange auf. Zwingen Sie die Tubuli durch Drücken mit Zangen und entsorgen Sie die Tunika. HINWEIS: Beim Wegwerfen der Tunika könnte es für einige nachgelagerte Anwendungen von Vorteil sein, dass arteria hoicularis zusammen mit der Tunika entfernt wird. Vermeiden Sie eine Beschädigung der seminiferous tubulies.</li>
	<li>Bewegen Sie die seminiferous Tubuli zu einer neuen Petrischale und gießen Sie genug sterile PBS, um den Boden der Petrischale zu bedecken. Als nächstes ziehen Sie die Tubuli vorsichtig auseinander, vermeiden aber, die Tubuli zu beschädigen. HINWEIS: Zu viel mechanische Beanspruchung wirkt sich auf das Transilluminationsmuster aus und beeinträchtigt die Lebensfähigkeit des Gewebes und seiner zellulären Architektur. Die Tubuli können ab diesem Zeitpunkt auch für ganzmontierte Immunostainierungen ohne Inszenierung (3B) verarbeitet werden. Manchmal reicht es aus, das Stadium nachträglich zu definieren, indem Antikörper gegen Proteine, die in differenzierender Spermatogonie exprimiert werden, wie SALL4, c-KIT und DNMT3A18,23,eingeschlossen werden. Die Dichte der Spermatogonie ist ein relativ zuverlässiger Indikator für die Stufe (Abbildung 2).</li>
</ol>2. Transilluminationsunterstützte Mikrodissektion
<ol><li>Legen Sie die Petrischale unter ein Seziermikroskop fest, indem Sie sie auf die Bühne kleben. HINWEIS: Es ist wichtig, die Petrischale gut zu kleben, um ihre Bewegung zu verhindern, die eine Vermischung der gesammelten inszenierten seminiferen Tubulensegmente verursachen könnte.</li>
	<li>Um das Lichtabsorptionsmuster von seminiferen Tubuli unter Fokus zu enthüllen, stellen Sie sicher, dass die Probe von unten beleuchtet wird und das Licht durch die Probe geht, d.h.es wird transbeleuchtet. ANMERKUNG: Die Menge des absorbierten/gestreuten Lichts ist relativ zum Chromatinkondensationsgrad in länglichen Spermaatiden und ihrer Bündelung im Seminifer-Tubuli: Je kondensierter, desto mehr Licht absorbiert wird, d. h., erscheint dunkler.</li>
	<li>Machen Sie sich mit dem Lichtabsorptionsmuster verschiedener Stufen vertraut, wie in Abbildung 2, Abbildung 5A und Abbildung S1 beschrieben, indem Sie Tubulenbündel mit feinen Zangen vorsichtig bewegen. HINWEIS: Die Stadien folgen einander immer in einer logischen Reihenfolge und bilden die Welle des seminiferösen Epithels. Es ist jedoch wichtig zu wissen, dass die Richtung der spermatogenen Welle gelegentlich umkehrt und dann wieder zurückkehrt (auch bekannt als Modulationen4,9), was manchmal das Verfahren erschwert. Auch die Länge der einzelnen Stufen, in Bezug auf wie viele mm Tubuli, variiert erheblich.</li>
	<li>Heben Sie den Interessent vorsichtig mit Zangen mit einer Hakenspitze an, und schneiden Sie dann ein Segment von geeigneter Länge mit einer Mikrodissektionsschere (siehe Ergänzendes Video 1). Ein Haken an der Spitze der Zange erleichtert das Heben und Halten eines Tubuli und hilft, ein Drücken zu vermeiden. HINWEIS: Die Länge der zu schneidenden Segmente hängt von nachgelagerten Anwendungen ab. Für die Sammlung von gepoolten Tubulenstücken eines bestimmten Stadiums für die Protein- oder RNA-Analyse12,13 (II–V, VII–VIII und IX–XI, Abbildung 5B) beträgt die Länge typischerweise 2–5 mm. Bei Verwendung der Standard-Phenol-Chlorform-Extraktion können aus 1 mm Tubuli rund 200 ng RNA abgeleitet werden. Bei der Vollmontage der Färbung von inszenierten Tubulesegmenten sollte die Länge der Segmente >5 mm betragen. Bei Squash-Präparaten sollte die Länge der Segmente 1–2 mm nicht überschreiten, da die Zellen in der Mitte des Segments möglicherweise nicht verlassen werden, wenn sie zu lang sind. Verwenden Sie eine mm-Skala unter der Petrischale für eine genaue Messung der Tubuslänge.</li>
</ol>3. Immunostainierung verschiedener Präparate
<ol><li>Squash-Vorbereitung: Stufenverifizierung und Immunfärbung HINWEIS: Bühnenspezifische Tubulenstücke können auf einem Mikroskopschlitten mit einem Deckglas zerquetscht werden, um morphologische Analysen lebender Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie und anschließende Immunfärbung durchzuführen. Ein Anfänger wird empfohlen, diesen Ansatz zu verwenden, um die Stadien zu überprüfen, wenn er mit der transilluminationsunterstützten Mikrodissektionsmethode vertraut wird.<ol>
<li>Sammeln Sie das Segment in einem Volumen von 10 l mit einer Pipette und bewegen Sie es auf ein Mikroskopschlitten.</li>
		<li>Squash die Tubule durch Legen eines Deckglases (20 mm x 20 mm) vorsichtig auf den Tubuli. Als Ergebnis fließen Zellen aus dem Tubuli und bilden eine Live-Zell-Monoschicht. Legen Sie ein Filterpapier auf den Rand des Deckglases, um die Ausbreitung der Zellen zu erleichtern. Vermeiden Sie es, die Zellen zu sehr zu zerquetschen, um sie am Leben zu erhalten.</li>
		<li>Überwachen Sie die Zellausbreitung unter dem Mikroskop. Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit 40-fachem Ziel, um die Phasenerkennung zu überprüfen, indem Sie die vorhandenen Zelltypen untersuchen (Abbildung 2, Abbildung S2).</li>
		<li>Sobald sich die Zellen zu einer runden Monoschicht von beiden Enden des Tubuli ausgebreitet haben, tauchen Sie den Schlitten in einen Behälter, der flüssigen Stickstoff enthält, während Sie ihn mit Zange halten. Halten Sie es 10 s unter Wasser. Alternativ legen Sie die Rutsche zum Einfrieren auf eine Trockeneisplatte.</li>
		<li>Entfernen Sie das Deckglas, indem Sie es mit einem Skalpell abdrehen.</li>
		<li>Fahren Sie ohne Verzögerung mit der Fixierung fort und legen Sie die Rutsche schnell in einen Behälter mit 90% Ethanol für 2–5 min. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Squash-Zubereitung nicht auftaut, bevor Sie sie auf 90% Ethanol legen. Andere Fixative können auch verwendet werden, wie Aceton, für 10 min.</li>
		<li>Lufttrocken und lagern bei Raumtemperatur (RT) (bis zu einigen Tagen) oder bei -80 °C (langfristig).</li>
		<li>Zur Immunfärbung die Proben in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei RT nachfixieren.</li>
		<li>In PBS abspülen und mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min permeabilisieren.</li>
		<li>In PBS abspülen und einen Fettring um jede Squashprobe ziehen.</li>
		<li>Fügen Sie 50–100 l von 10% BSA (Rinderserumalbumin) in 0,1% Tween in PBS (PBST) in den Fettring und Blockproben für 30 min bei RT hinzu.</li>
		<li>Entfernen Sie die BSA-Lösung und inkubieren Sie mit einem primären Antikörper, der in 10% BSA in PBST für 1 h bei RT verdünnt wird.</li>
		<li>Waschen Sie 3x für 5 min mit PBST.</li>
		<li>Inkubieren Sie mit einem sekundären Antikörper, der in 10% BSA in PBST verdünnt wird. HINWEIS: Um die Akrosomen zu färben, können die Proben mit Rhodamine-beschriftetem Erdnuss-Agglutinin-Antikörper (PNA, 1:1000) in 10% BSA in PBST für 1 h bei RT(Abbildung S3) anstelle spezifischer Primär- und Sekundärantikörper inkubiert werden.</li>
		<li>Waschen Sie 3x für je 5 min mit PBST, spülen Sie mit PBS und montieren Sie mit einem Mountant, das DAPI enthält.</li>
	</ol></li>
	<li>Ganzer Immunfärbung von seminiferösen Tubuli HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt die Vollmontagefärbung für inszenierte (ab Schritt 2.4) Tubulesegmente. Wenn ein Forscher eine vollwertige Färbung ohne Inszenierung durchführen möchte (ab Schritt 1.5), achten Sie auf Noten in 3.2.1 und 3.2.7.<ol>
<li>Mit einer Pipette die Tubulesegmente (ab Schritt 2.4) in eiskaltem PBS in ein 15 ml kegelförmiges Rohr übertragen und auf Eis sedimentieren lassen. HINWEIS: Wenn Sie nicht inszenierte Tubuli von 1.5. verwenden, trennen Sie die Tubuli in einer Petrischale, indem Sie mehrmals auf eine gekippte Schale pfeifen und zurückpfeifen. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette mit einer geschnittenen Spitze. Dieser Schritt soll die Struktur des Gewebes öffnen. Vermeiden Sie jedoch zu viel Pipettierung, da es die Tubuli beschädigen könnte. Die Sedimentation von Tubuli wird einige Dutzend Sekunden dauern. Kleine Tubulenfragmente, interstitielle Zellen und Zellablagerungen bleiben im Überstand.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand (SN) vorsichtig durch Pipettieren oder mit einem Aspirator. 10 ml eiskaltes PBS hinzufügen und durch Inversion mischen.</li>
		<li>Lassen Sie Sediment eimt und dann entfernen SN wie zuvor.</li>
		<li>5 ml 4% PFA hinzufügen und für 5 h auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei +4 °C fixieren. HINWEIS: Die Fixationszeit hängt von den Proteinen von Interesse und ihrer subzellulären Lokalisierung ab. Für kern- und zytoplasmatische Proteine ist eine 2-h-Fixierung in der Regel ausreichend, jedoch Membranmarker, wie z. B. GFR1 (GDNF-Familienrezeptor alpha 1; Abbildung 6A,B), profitieren von einer längeren Fixierung, bis zu 6 h.</li>
		<li>Sedimentieren zulassen, SN (PFA) wie bisher entfernen und kurz abspülen, indem 10 ml PBS hinzugefügt und das Rohr invertieren.</li>
		<li>Sedimentieren, SN wie bisher entfernen und den PBS-Waschschritt dreimal für jeweils mindestens 10 min auf einem rotierenden Tisch bei +4 °C wiederholen und bei +4 °C färben oder lagern. HINWEIS: Wenn die Arbeitsbedingungen steril sind und die Proben gereinigt werden können, können sie mindestens einige Wochen gelagert und verwendet werden. Alternativ können Sie Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% (w/v) aus einer 2%igen Stofflösung hinzufügen, um die Tubuli vor der Lagerung bei +4 °C zu erhalten.</li>
		<li>Mit einer 1-ml-Pipette 10–20 feste Tubulisegmente in ein 2-ml-Rundbodenrohr verschieben. SN sedimentieren und entfernen lassen. HINWEIS: Wenn Sie mit langen Tubuli arbeiten, die nicht inszeniert wurden, gießen Sie die Tubuli auf eine Petrischale und schneiden Sie mit Mikrodissektionsschere und Zangen Segmente von etwa 5–20 mm. Zu lange Segmente verwickeln sich während des Färbevorgangs, während zu kurze Segmente leicht verloren gehen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml von 2% BSA + 10% FBS (fetales Rinderserum) in 0,3% Triton X-100 in PBS (PBSX) hinzu. Block für mindestens 1 h auf einem rotierenden Tisch (20–30 Rpm) bei RT.</li>
		<li>Spülen Sie mit 1 ml PBSX, entfernen Sie SN durch Pipettieren und fügen Sie 250 L primären Antikörper in 1% BSA in PBSX verdünnt (1:100–1:2000 Verdünnung) hinzu. 2 h bei RT oder über Nacht bei +4 °C auf einem rotierenden Tisch (20–30 Rpm) inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die Antikörperlösung durch Pipettieren und spülen Sie die Tubuli mit 1 ml PBSX wie oben beschrieben. Dreimal für 1 h in PBSX auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei RT waschen. HINWEIS: Nach diesem ersten Waschen kann die Probe bei Bedarf bei +4 °C über Nacht gelassen werden.</li>
		<li>Entfernen Sie SN, und fügen Sie 250 L sekundären Antikörpers hinzu, der in 1% BSA in PBSX verdünnt wird (typischerweise 1:500 Verdünnung eines fluoreszierenden Antikörpers). In Folie abdecken und auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei RT für 1 h inkubieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie 3.2.10.</li>
		<li>Entfernen Sie schließlich SN und gießen Sie die Tubuli auf ein Mikroskopschlitten. Mit Gel-Ladespitzen können Sie Tubuli in Linearstreifen sanft trennen und anordnen. Überschüssigen Puffer abtropfen lassen und Montagemedium und Einen Deckelschlupf hinzufügen. HINWEIS: Vermeiden Sie das Trocknen der Tubuli, während Sie sie arrangieren. Eine Gegenfärbung der Kerne mit DAPI ist in den meisten Fällen nicht notwendig. Versiegeln Sie die Kante des Deckels mit Nagellack, um Probentrocknung und Verschlechterung zu verhindern. Dias können vor der Bildgebung 1–2 Wochen lang bei +4 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+spermatogenesis+in+the+mouse+and+timing+of+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium.</a> The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).</li><li>Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+spermatogenesis+in+mammals:+seminiferous+epithelium+cycle+and+spermatogonial+renewal.">Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.</a> Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).</li><li>Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wave+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">The wave of the seminiferous epithelium in the rat.</a> American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).</li><li>de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., Fran&#231;a, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology-Overview+and+Histology.">Testis Physiology-Overview and Histology.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Leblond, C. P., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).</li><li>Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+seminiferous+epithelium.">Regulation of the seminiferous epithelium.</a> Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+analysis+of+seminiferous+tubules+and+spermatogenic+waves+in+mice.">Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice.</a> Reproduction. 154 (5), 569-579 (2017).</li><li>Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and histopathological evaluation of the testis. , (1990).</li><li>Parvinen, M., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+living+spermatogenic+cells+of+the+mouse+by+transillumination-phase+contrast+microscopic+technique+for+"in+situ"+analyses+of+DNA+polymerase+activities.">Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities.</a> Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).</li><li>Ventel&#228;, S., M&#228;kel&#228;, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+stage-specific+stem+cell+niche+enriched+by+Nanog-positive+spermatogonial+stem+cells+in+the+mouse+testis.">Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis.</a> Stem Cells. 30 (5), 1008-1020 (2012).</li><li>Faisal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+USF1+is+required+for+maintenance+of+germline+stem+cells+in+male+mice.">Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice.</a> Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).</li><li>Wright, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stage-specific+proteins+synthesized+by+rat+seminiferous+tubules.">Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules.</a> Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).</li><li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+gene+expression+is+a+fundamental+characteristic+of+rat+spermatogenic+cells+and+Sertoli+cells.">Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).</li><li>Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+flow+cytometric+analysis+of+mouse+seminiferous+epithelium.">DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium.</a> Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+promotes+germ+cell+survival+in+the+rat+testis.">Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis.</a> Reproduction. 142 (5), 711-721 (2011).</li><li>La, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dynamic+undifferentiated+cell+states+within+the+male+germline.">Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline.</a> Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).</li><li>Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+rat+seminiferous+tubular+segments+from+defined+stages+of+the+epithelial+cycle+morphologic+and+immunolocalization+analysis.">In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis.</a> Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).</li><li>Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enzyme+quantitation+of+the+stages+of+the+seminiferous+epithelial+wave+in+the+rat.">Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat.</a> The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Chan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cell+activity+is+sustained+by+SALL4-dependent+silencing+of+distinct+tumor+suppressor+genes.">Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).</li><li>Lokka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+localization+and+functions+of+macrophages+during+the+development+of+testis.">Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis.</a> Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+physiology:+Spermatogenic+cell+syncytium.">Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+commitment+to+meiosis.">Spermatogenesis: The commitment to meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).</li><li>Parvinen, M., Parvinen, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products.">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li><li>Parvinen, M., S&#246;derstr&#246;m, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis.">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die oben beschriebene transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode ermöglicht einen stufenorientierten Ansatz zur Untersuchung der Spermatogenese. Die Spermatogenese ist ein hochsynchronisierter Prozess, und alle wichtigen Schritte während der spermatogenen Differenzierung werden stufenabhängig reguliert und ausgeführt, wie Z.B. Differenzierungsverpflichtung (in den Stadien VII-VIII), Beginn der Meiose (VII-VIII), meiotische Teilungen (XII), Beginn der Spermadehnung (VIII) und Spermiation (VIII)1,26,27. Die phasenorientierte Analyse bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um diese besonderen Ereignisse zu untersuchen, die auf bestimmte Schritte der Spermatogenese beschränkt sind und daher nur in definierten Stadien des seminiferen Epithelzyklus gefunden werden. Die Beherrschung der Methode erfordert einige Praxis und die Verwendung eines hochwertigen Seziermikroskops und richtige Beleuchtungsbedingungen sind der Schlüssel zum Erfolg. Die Implementierung dieser Methode als Teil des täglichen Toolkits hat die Fähigkeit, die Wirkung und biologische Relevanz der Forschung über männliche Fortpflanzungsfunktionen erheblich zu verbessern, indem eine genauere Zerlegung molekularer Ereignisse während der Spermatogenese ermöglicht wird.
Alle von uns untersuchten WT-Mausstämme zeigen ein ähnliches Transilluminationsmuster und zeigen konservierte Zellassoziationen in Stadien des seminiferen Epithelzyklus. Unter der Voraussetzung, dass sich die spermiogene Differenzierung von Keimzellen nicht wesentlich von WT-Mäusen unterscheidet, gilt das gleiche auch für alle von uns untersuchten Knock-out-Mausmodelle. Darüber hinaus kann es auf andere Arten angewendet werden, die längsförmige segmentale Anordnung von Stadien des seminiferen Epithelzyklus7aufweisen. Arten mit nicht-segmentalen Stadien (z. B. menschliche Stadien) können jedoch nicht verwendet werden. Angesichts der wesentlichen Rolle der Chromatinkondensation bei der Festlegung des Transilluminationsmusters bei der Definition des Transilluminationsmusters ist klar, dass jede Fehlregulation dieses Prozesses unweigerlich die Umsetzung dieser Methode beeinträchtigen wird. Bei jugendlichen Mäusen und jungen Erwachsenen (5-6 Wochen) ist das Transilluminationsmuster noch nicht vollständig etabliert, daher sollten nur Mäuse verwendet werden, die älter als 8 Wochen sind. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass das Drücken und Ziehen der Tubuli unweigerlich auf das Transilluminationsmuster einwirkt, da es die zelluläre Architektur innerhalb des seminiferen Epithels verzerrt.
Die isolierten seminiferen Tubulensegmente können auch kultiviert werden, was die Ex-vivo-Beobachtung und Manipulation von Spermatogenese-gekoppelten Prozessen, einschließlich Meiose, ermöglicht. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu gewährleisten und den Abbau von RNA und Protein zu verhindern, sollten die Proben nicht mehr als 2 Stunden nach dem Opfern der Maus gesammelt und verarbeitet werden. Für ex vivo Kultur der seminiferous tubulies, sollte die Zeit vom Opfer bis zum Beginn der Kultur nicht mehr als 1 Stunde. Die Integrität von Tubule-Fragmenten kann in der Regel bis zu 72 Stunden in vitro aufrechterhalten werden, wenn sie richtig geerntet werden.
Das Stadium des seminiferen Epithelzyklus kann mit einer Phasenkontrastmikroskopie von Squashpräparaten16überprüft und noch genauer definiert werden. Die Mikroskopie wird an lebenden Zellen durchgeführt, was eine zusätzliche Dimension in die Analyse einführt und die Beobachtung von Organellen- oder Zellbewegungen in bestimmten Stadien der Spermatogenese28,29,30ermöglicht. Die Phasenkontrastmikroskopie liefert eine exakte Inszenierung für die nachfolgende Immunfärbung, die eine sehr detaillierte Analyse der Proteinexpression und Lokalisierungsdynamik während der Spermatogenese ermöglicht, einschließlich stufenspezifischer Veränderungen.
Während Zellen in Squashpräparaten aus dem epitheliaalen Kontext freigesetzt werden, ermöglichen ganzmontierte Immunostainierungen von Tubulisegmenten die Untersuchung von spermaatogenen Zellen in ihrer physiologischen Umgebung. Daher können Vollmontagepräparate eine bessere Visualisierung der seminiferous tubbule Architektur und ihrer interzellulären Kontakte bieten als die Immunfärbung auf Querschnitten. Wichtig ist, dass die transilluminationsunterstützte Inszenierung der Tubulesegmente vor der Immunfärbung den Ansatz noch stärker macht, indem Informationen über die spezifische Stufe eines bestimmten Segments eingebunden werden. Die Vollfärbung ist ein besonders nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Zellen an der Peripherie seminiferöser Tubuli, wie peritubululare Myoidzellen, peribuläre Makrophagen und Spermatogonie, könnte aber auch neue Erkenntnisse in der Forschung an meiotischen und postmetiotischen Keimzellen eröffnen.

Die Differenzierung männlicher Keimzellen von diploiden Spermatogonien zu reifen haploiden Spermatozoen, d.h.Spermatogenese, ist ein komplexer Prozess, der im Epithel von seminiferen Tubuli in den Hoden eines sexuell reifenIndividuums1 stattfindet. Mitotische Nachkommen von A1-Spermatogonien teilen sich zuerst fünfmal, um die differenzierungsgebundene Population zu erweitern, und treten dann als Spermatozyten ein, die letztlich zu haploiden Spermatoiden führen. Die Differenzierung von runden Spermien in Spermatozoen, d.h.Spermiogenese, beinhaltet komplexe Veränderungen in der zellulären Morphologie, einschließlich nuklearer Verdichtung und Konstruktion von spermienspezifischen Strukturen wie dem Akrosom und dem Flagellum. In der Maus dauert der gesamte Prozess der Spermatogenese 35 Tage, um2,3.
An jedem Gebietsschema beherbergt das Seminiferepithel bis zu fünf Kohorten differenzierender Keimzellen sowie der Keimbahnstamm-/Vorläuferzellen und der somatischen Sertolizellen1. Differenzierende Keimzellen bilden konzentrische Schichten, deren Zusammensetzung vorhersagbar ist, und haploide Zellen in einem bestimmten Entwicklungsschritt immer mit bestimmten Arten von Spermatozyten und Spermatogonie4,5assoziieren. Daher beherbergt jeder Querschnitt eines Tubuli Kohorten von Keimzellen mit konstanter Zusammensetzung. Diese spezifischen Zellassoziationen werden als die Stadien des seminiferen Epithels definiert. Stufen an sich stellen keine stagnierenden Kontrollpunkt-ähnlichen Zustände dar, sondern entwickeln sich ständig weiter, wenn die Differenzierung von Keimzellkohorten in Synchron1,2,6fortschreitet. Bei Mäusen gibt es 12 Stufen (I-XII)2, die segmental entlang der Längsachse des seminiferösen Tubuli angeordnet sind, und sie folgen einander in einer logischen Reihenfolge und bilden so die Welle des seminiferösen Epithels oder der spermaatogenen Welle7,8,9 ( Abbildung1). Die Vollendung der Spermatogenese dauert vier Zyklen, und hierarchische Schichten oder Kohorten von differenzierenden Keimzellen innerhalb eines seminiferösen Tubbulenquerschnitts sind zeitlich ein Seminiferzyklus voneinander entfernt. Die Länge des Zyklus ist artabhängig und in der Maus dauert jeder Zyklus 8,6 Tage10.
Die Stadien können auf der Grundlage der zellulären Zusammensetzung und Organisation des seminiferen Epithels auf den histologischen Hodenabschnitten5 (Abbildung 1 und Abbildung 2) identifiziert werden. Die histologische Analyse ist jedoch mühsam, zeitaufwändig und erfordert eine Fixierung und Färbung und kann daher nicht auf lebendes Gewebe angewendet werden. Wichtig ist, dass die Inszenierung auch auf lebendem Gewebe unter einem Seziermikroskop durchgeführt werden kann, indem die unterschiedlichen Lichtabsorptions-/Streumuster genutzt werden, die in verschiedenen Stadien des Zyklus dargestellt werden (Abbildung 2). Die Fähigkeit jeder Stufe, Licht zu absorbieren und zu streuen, ist relativ zum Chromatinkondensationsgrad der späten postmeiotischen Spermaatien, die jede bestimmte Stufe Wirt ist, und der Verpackung dieser Zellen in Bündeln7,11. Die Spermadifferenzierung, d.h.Spermiogenese, ist weiter in 16 Entwicklungsschritte unterteilt, darunter 8 Schritte runder Sperma (Schritt 1-8) und 8 Schritte der lästigen Spermatiendifferenzierung (Schritte 9-16)(Abbildung 1). Schritt 9-11 langlängige Spermatoren (Stufe IX-XI) zeigen nur einen niedrigen Chromatinkondensationsgrad, was zu einer geringen Menge an Licht führt, die absorbiert wird. Die Chromatinkondensation beginnt in Schritt 11 Spermaatiden (Stufe XI), und Schritt 15-16 längliche Spermatien (Stufe IV-VIII) enthalten vollständig kondensiertes Chromatin und weisen daher eine maximale Lichtabsorption auf (Abbildung 3). Chromatin muss kondensiert werden, um fest in den Spermienkopf gepackt zu werden. Weitere Faktoren, die zum Lichtabsorptionsmuster beitragen, sind die Lage der länglichen Spermatoide innerhalb des Epithels (Basal vs. apikal) und die Bündelung von länden Spermaatiden (ausgesprochen in den Stadien II-V)11 (Abbildung 3). Bündel werden als Flecken in der Mitte der Tubuli und als Streifen an den Rändern unter einem Seziermikroskop und je kondensierter das Chromatin, desto dunkler der Fleck/Streifen11.
Dieser Artikel beschreibt die Verwendung der transilluminationsunterstützten Mikrodissektionsmethode zur Isolierung seminiferöser Tubulisegmente, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen. Einmal isoliert, können inszenierte Tubulesegmente verschiedenen nachgelagerten Analysen unterzogen werden, einschließlich biochemischer RNA- und Proteinanalysen12,13,14,15, Durchflusszytometrie16, ex vivo Tubule-Kultur17 und Immunostaining18. Hier bieten wir auch detaillierte Nachflussprotokolle zur Vorbereitung von gequetschten Monolayern von inszenierten Tubulesegmenten für die morphologische Analyse von Lebenden Zellen und die anschließende Immunfärbung sowie für die ganzmontierte Immunfärbung von Tubulensegmenten. Der Workflow in Abbildung 4auf den Punkt gebracht.
Die transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode ermöglicht dank der synchronisierten zellulären Zusammensetzung der Stadien eine genaue Identifizierung und Isolierung von Keimzellen bei bestimmten Differenzierungsschritten. Wichtig ist, es ermöglicht auch die Untersuchung von stadium-abhängigen Ereignissen während der Spermatogenese auf lebendem Gewebe. Angesichts des Fehlens skalierbarer In-vitro-Modelle für die Spermatogenese hat diese Methode auch einen einzigartigen Vorteil, gezielte kurzfristige Entwicklungs- und toxikologische Studien an stufenspezifischen Tubulesegmenten ex vivo12,17zu ermöglichen. Während wir die Methode hier für die Maus beschreiben, kann das gleiche Verfahren auf alle Säugetierarten mit Längs- und Segmentanordnung von seminiferen Epithelstadien angewendet werden, wie die Ratte4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

Spermatogenese ist ein einzigartiger Differenzierungsprozess, der letztlich zu einem der unterschiedlichsten Zelltypen des Körpers, dem Sperma, führt. Die Differenzierung von Keimzellen erfolgt in den zytoplasmatischen Taschen somatischer Sertolizellen, die gleichzeitig 4 bis 5 Generationen von Keimzellen beherbergen und ihre Entwicklung koordinieren und synchronisieren. Daher ist die Zusammensetzung der Keimzelltypen innerhalb eines Querschnitts konstant, und diese Zellassoziationen werden auch als Stadien (I–XII) des seminiferen Epithelzyklus bezeichnet. Wichtig ist, dass Stadien auch aus intakten seminiferen Tubuli identifiziert werden können, basierend auf ihren differenziellen Lichtabsorptions-/Streueigenschaften, die durch Transillumination aufgedeckt werden, und der Tatsache, dass die Stufen einander entlang des Tubuli in numerischer Reihenfolge folgen. Dieser Artikel beschreibt eine transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode zur Isolierung seminiferöser Tubulensegmente, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus der Maus darstellen. Das Lichtabsorptionsmuster seminiferöser Tubuli wird zunächst unter einem Seziermikroskop untersucht, und dann werden Tubulensegmente, die bestimmte Stufen darstellen, geschnitten und für nachgelagerte Anwendungen verwendet. Hier beschreiben wir Immunstainierungsprotokolle für stufenspezifische Squashpräparate und für intakte Tubulesegmente. Diese Methode ermöglicht es einem Forscher, sich auf biologische Ereignisse zu konzentrieren, die in bestimmten Phasen der Spermatogenese stattfinden, und bietet so ein einzigartiges Werkzeug für entwicklungstechnische, toxikologische und zytologische Studien der Spermatogenese und der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen.

Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Dieses Protokoll beschreibt die transilluminationsunterstützte Mikrodissektion von Segmenten von erwachsenen Mausseminiferous Tubuli, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen, und Zelltypen darin und anschließende Immunostainierung von Squashpräparaten und intakten Tubulisegmenten.

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

The Reproductive System

SCIENTISTS IN ACTION

6.8K Aufrufe.  University of Turku, Turku, Finland. Dieses Protokoll beschreibt die transilluminationsunterstützte Mikrodissektion von Segmenten von erwachsenen Mausseminiferous Tubuli, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen, und Zelltypen darin und anschließende Immunostainierung von Squashpräparaten und intakten Tubulisegmenten.