המחברים רוצה להכיר את הבריאות הלאומיים ואת רפואי מחקר המועצה של אוסטרליה פרויקט גרנט APP1103176 על התמיכה של עבודה זו.

כל ההליכים ניסויית הכוללת אוסף רקמה חיה אושרו על-ידי אוניברסיטת ניוקסל טיפול בעלי חיים, יו ר ועדת האתיקה.
1. immunofluorescence מכתים הסעיפים Epididymal פרפין-מוטבע (דמויות 1 ו- 2)
<ol><li>מיד לאחר המתת החסד של עכברים בוגרים באמצעות אינהלציה2 CO (עכברים שוויצרי, מעל בן 8 שבועות), בזהירות לנתח יותרת האשך (באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה) ללא עודפי רקמת חיבור ושומן, לטבול לשבועיים של Bouin פתרון (> עשר פעמים משקל נפח/רקמות) עבור קיבעון לילה.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה עם 70% אתנול עם 2 × שינויים מדי יום במשך יומיים, ואז מייבשים באמצעות אתנול מדורגת (70%, 95% ל- 100%) לקראת חדירה והטבעה בתוך בלוק פראפין.</li>
	<li>בסעיף הבלוקים פרפין-עובי של 4-6 מיקרומטר ו הר בשקופיות כהכנה immunofluorescence מכתים.</li>
	<li>בשכונה fume, dewax הסעיפים פרפין epididymal על-ידי הוספת כמות מספקת של קסילן הצנצנת שקופית לחלוטין לטבול בסעיף רקמות (3 × 5 דקות כל פעם).</li>
	<li>נתרענן הסעיפים רקמות על ידי טבילת בפתרונות אתנול מדורגת מדולל מטוהרים H2O (100% אתנול 5 דקות, 100% אתנול 5 דקות, אתנול 90% 1 דקות, 80% אתנול 1 דקות, אתנול 70% 1 דקות, 50% אתנול 1 דקות).</li>
	<li>לשטוף את הסעיפים בצנצנת השקופית פעם במשך 5 דקות בתמיסת פוספט buffered מספיקות (PBS) לחלוטין לטבול סעיף הרקמה כולה (בצע את ההוראות עבור כל שוטף עוקבות).</li>
	<li>Decant אנטיגן מתאימות אחזור פתרון (כלומר., 10 mmol/L סודיום ציטרט, 50 mmol/L טריס pH 10.5 או solution(s) אחזור אנטיגן חלופיים, בהתאם אנטיגן יזוהו) לתוך השקופית מתלה במיקרוגל עד רתיחה. לטבול את השקופיות לתוך פתרון זה והנושא הסעיפים רקמות חום-induced אנטיגן אחזור בתנאי אופטימיזציה עבור הפרט נוגדנים (ראה טבלה 1). התראה: ודא כי השקופיות לגמרי שקועים בפתרון אחזור אנטיגן במהלך תהליך השחזור אנטיגן.</li>
	<li>הסר את מיכל שקופית מיקרוגל, מגניב לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות עם PBS ולהשתמש עט מרקר דוחה נוזלים שקופית לאתר סביב סעיף הרקמה.</li>
	<li>למקם את השקופיות במיכל humidified (שנוצרו על ידי רקמה בטעימת בבסיס של המיכל) ולהחיל פתרון חסימה (3% BSA/PBS, בעבר מסונן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר) עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש לשטוף את השקופיות פעם אחת עם PBS.</li>
	<li>דגירה הסעיפים עם המתאים נוגדן ראשוני מדולל ריכוז השפעול ממוטבת מסוננת 1% BSA/PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (יצירת עבור אנטי-DNM1, DNM2 ו- DNM3 נוגדנים; בטחונות עבור נוגדן anti-ATP6V1B1, ראה טבלה של חומרים לפרטים נוגדנים). הערה: כדי להבחין ספציפית מ מחייב שאינם ספציפיים נוגדנים, יש צורך לכלול שלילי מחמירים (כלומר., נוגדנים משניים בלבד, ראשי נוגדן preabsorbed נגד immunizing פפטיד) פקדים חיובית24.</li>
	<li>לחמם את השקופיות על-ידי הצבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות 3 × עם PBS על פלטפורמה חזק (60 סל ד) למשך 10 דקות.</li>
	<li>דגירה הסעיפים עם נוגדן המשני המתאים מדולל 1% BSA/PBS (מסונן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר) ב 37 ° C עבור 1 h (דילול 1:400 עבור כל נוגדנים משניים, ראה טבלה של חומרים לפרטים נוגדנים). התראה: למנוע את המיכל שקופית בחושך שלב זה ואילך. תיוג כפול, בחרו שילוב תואם של נוגדנים משניים (כלומר., נוגדנים המשני חייב הועלו מינים שונים).</li>
	<li>לשטוף את השקופיות 3 × עם PBS על פלטפורמה חזק (60 סל ד) למשך 10 דקות.</li>
	<li>Counterstain הסעיפים propidium יודיד (PI, 7.48 μmol/L) או 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, 4.37 μmol/L) למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר לתייג את גרעין התא.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות פעמיים עם PBS על פלטפורמה חזק (60 סל ד) למשך 5 דקות.</li>
	<li>הר הסעיפים עם 10% Mowiol 4-88 המבושלות פתרון של גליצרול 30% 0.2 מול/ליטר טריס (pH 8.5) ו- 2.5% 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-אוקטן.</li>
	<li>לסגור את coverslip עם הלק ולאחסן את השקופיות ב 4 ° C להסתכלות לעתיד. התראה: מומלץ לבצע ההדמיה של השקופיות ברגע המעשית לאחר ההכנה כדי למנוע אובדן מוגזם של זריחה.</li>
</ol>בידוד 2 של Epididymosomes מן העכבר Caput יותרת האשך (איור 3)
<ol><li>מיד לאחר המתת החסד של עכברים בוגרים באמצעות אינהלציה2 CO (שוויצרי עכברים מעל בן 8 שבועות), perfuse להערכת שלהם עם PBS (טרום התחמם עד 37 ° C) כדי לצמצם הזיהום בדם של הרקמה epididymal. התראה: פלזמה דם מכילה אוכלוסיות מגוונות של exosomes, אשר גודל דומה ל- epididymosomes25. ניתן לקבל גישה היעילות של סיווג דם מרקמות epididymal דרך הביקורת של המגזר הראשוני, קטע epididymal vascularized מאוד ממוקם proximal את פלח caput (כלומר., אזור 1, איור 1A)</li>
	<li>בזהירות לנתח האשך ללא שומן שמעליה, רקמת חיבור, ולאחר מכן לשטוף עם מדיום Biggers, ויטני, Whittingham שונה (BWW; pH 7.4, osmolality של 300 mmol/ק"ג מים26,27) כדי להפחית את כל הפוטנציאל עבור משטח זיהום בדם.</li>
	<li>כתם הרקמה epididymal כדי להסיר עודפי מדיה, לנתח caput יותרת האשך (כלומר., אזורי בתוך 2-5 איור 1A) העברה על צלחת פטרי טריים (35 × 10 מ"מ) המכיל BWW בינונית. ודא כי כמות בינונית מספיקה עבור ההחלמה הסופית. הערה: עבור 6 caput אפידידימיס, מומלץ להשתמש mL 1.1 של המדיום כדי לאפשר החלמה של µL ~ 900, אז באופן שווה לפצל ואינה חלה על גבי של 2 מעברי צבע מוכן מראש (ראה שלב 2.9).</li>
	<li>עושים מספר חתכים קטנים לתוך הרקמה caput עם סכין גילוח. לא מינצ הרקמה, ובכך להימנע מזיהום הדגימה עם תוכן cytosolic מוגזמת. דגירה לצלחת המכילה את הרקמה עם עצבנות קלה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשחרר את התוכן luminal.</li>
	<li>לסנן את המתלים הנובעת דרך ממברנות מיקרומטר 70 לפנות את הפסולת הסלולר.</li>
	<li>לאסוף את פילטרט של ונושא זה לצעדים צנטריפוגה רצופים ב 4 ° C עם הגדלת מהירות כדי לסלק פסולת הסלולר (כלומר., × 500 g2,000 × g, × 4,000 גרם, 8,000 × g, 5 דקות לכל; 17,000 × g עבור 20 דקות, לבסוף 17,000 × g של 10 דקות נוספות, או עד אין גלולה נוצר לאחר צנטריפוגה). שים לב: חשוב להעריך את הצבע של בגדר לאחר השלב צנטריפוגה g 500 × הראשוני כדי להבטיח דם מזערית זיהום קיים. למחוק דוגמיות שבו גלולה זו מציגה את צבע ורוד.</li>
	<li>הכן iodixanol מקוטע מעברי צבע (הכוללת 40%, 20%, 10%, 5% שכבות) על ידי דילול מדיום הדרגתיות צפיפות (הכוללת 60% (w/v) iodixanol מימית) עם פתרון של 0.25 סוכרוז מול/ליטר ו- 10 mmol/L טריס (pH 7.5).</li>
	<li>מכינים את המילוי ההדרגתי צינור ultracentrifuge (11 × 35 מ מ), עם כל חלק של 450 µL (איור 3). מבחינה ויזואלית לבדוק את המילוי ההדרגתי לאחר היישום של כל שבר כדי להבטיח כי הממשקים נוצרות בהצלחה בין כל שכבה ושכבה לפני טעינה הדגימה נוזלים epididymal. להכין טרי הדרגתי בכל יום של שימוש, עם זאת, ניתן לשמר את דגימת נוזל luminal epididymal ב 4 ° C עבור עד 2 שעות לפני הטעינה.</li>
	<li>להוסיף בזהירות 450 µL של epididymal luminal נוזלים השעיה (תואם להחומר שנאסף מן caput של 3 אפידידימיס) על גבי של מעבר צבע יחיד.</li>
	<li>Ultracentrifuge מעברי הצבע ב × 160,000 g ב 4 ° C עבור 18 h. התראה: מאז צנטריפוגה זו מתנהל במהירות גבוהה מאוד, לכל הצינורות ultracentrifuge חייב להיות לזווג ומאוזנת בדיוק. בדוק הצינורות כדי להבטיח כי הם ללא כל נזק לעין, אשר עלול לסכן את תקינותם.</li>
	<li>הסר בעדינות שברים שווים 12 (כל אחד המורכב 185 µL) החל מהשכבה העליונה, מתקדמת לכיוון החלק התחתון של מעבר הצבע. בריכת שברים שווי ערך התאוששה מעבר הצבע, אם ישים (עד שני מעברי צבע). הערה: העכבר epididymosomes ביותר מועשרים שברים 9-1122, ראה איור 4 דיונים.</li>
	<li>לאחר ההתאוששות ואיגום של שברים 9-11, לדלל לתוך 2 מ"ל של PBS, ultracentrifuge את הדגימות ב 100,000 × g ב 4 ° C עבור 3 h (13 × 56 מ מ צינור) כדי הצניפה את epididymosomes. התראה: מאז בגדר epididymosome יכול להיות קשה לראות, ודא כי הכיוון של הצינורות הוא ציין כפי שהם ממוקמים בתוך הרוטור ולסמן את הצינור כדי לציין את מיקום ציפייה בגדר epididymosome. להבטיח כי כל שפופרת מכיל נפח מספיק (כלומר., העולה על 50% של קיבולת כוללת) לצמצם את הסיכון של קריסת צינור.</li>
	<li>בזהירות תשאף וזורקים את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר epididymosome.</li>
	<li>להעריך את הטוהר epididymosome (איור 4).</li>
	<li>Resuspend בגדר epididymosome לתוך בינוני הרצוי בהתאם היישומים במורד הזרם. למשל, BWW בינוני משמש בדרך כלל עבור הניסויים מעורבים הדגירה משותף עם spermatozoa, או לחילופין מאגר פירוק מתאים כהכנה הרזולוציה של פרוטאום epididymal מרחביות-בעמוד.</li>
</ol>3. immunofluorescence Staining של תאים mECap18
<ol><li>הכנת coverslips סטרילי (אמור להתנהל בשכונה התרבות התא)<ol>
<li>להשרות את coverslips (12 × 12 מ"מ) אתנול 70% 10 דקות ולחטא ע י ייבוש תחת טמפרטורה גבוהה מעל מנורת אתנול.</li>
		<li>מגניב של coverslip 10 s לפני העברת צלחת טוב 12.</li>
		<li>להחיל פתרון סטרילי פולי-L-ליזין לכסות את coverslip ולהתיישב 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לבטל את הפתרון פולי-L-ליזין ו לשטוף את coverslip עם סטרילי H2O או מתאים בינוני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה mECap18 תאים<ol>
<li>המעבר של aliquots של 2 × 105 תאים mECap18 כל טוב של הצלחת טוב 12 המכילה את coverslips.</li>
		<li>התרבות התאים עם mECap18 תא בינוני (DMEM בתוספת 1%-גלוטמין, 1% נתרן פירובט, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ו 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN μmol 50/L) המכיל עגל עוברית 10% סרום (FBS) בחממה 37 ° C תחת % 5 אווירה CO2 בן לילה.</li>
		<li>ברגע התאים לדבוק coverslip, למחוק את המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.</li>
		<li>להוסיף כמות מספקת של 4% paraformaldehyde (PFA) מדולל ב- PBS לטבול את כל coverslip ולתקן את התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
		<li>לבטל את הפתרון PFA ולשטוף את coverslips פעמיים ב- PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunofluorescence מכתים<ol>
<li>Permeabilize mECap18 תאים על ידי טבילה ב- 0.1% X-100 Triton ב- PBS למשך 10 דקות.</li>
		<li>יש לשטוף את coverslips עם PBS.</li>
		<li>לחסום mECap18 תאים עם 3% BSA והמשך עם immunolabeling של תאים ניצול פרוטוקולים מקבילה לאלו שתוארו מקטעי רקמת epididymal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. בידוד של חלבונים מאמצעי התרבות תאים ממוזגים
<ol><li>אוסף של תאים ממוזגים תרבות בינוני<ol>
<li>המעבר aliquots של 4 × 105 תאים mECap18 כל טוב של 6 טוב צלחת בינונית תא mECap18 בתוספת 10% FBS במשך 24 שעות ביממה.</li>
		<li>לשטוף תאים mECap18 שלוש פעמים עם mECap18 תא בינוני (להכין בלי FBS) כדי להסיר FBS שיורית וכל הקשורים חלבון מזהמים.</li>
		<li>להוסיף 1.5 מ של mECap18 תא בינוני (להכין בלי FBS) מכל קידוח, דגירה עם mECap18 תאים עבור 12 ח ב חממה 37° C מתחת 5% CO2. הערה: mECap18 תאים בשלב זה יכול להיות שקובעת אנטיגנים היעד השונות על פי תכנון ניסויים.</li>
		<li>לאחר 12 שעות דגירה, לאסוף את תא בינוני צנטריפוגה ב × 2,000 g 10 דקות להסיר את כל פסולת הסלולר. הערה: משך הדגירה הוא מסוגל להשתנות על פי הערכת עיצוב ניסיוני/קצה, תמורת זה הסובלנות של התא treatment(s) יישומית. מומלץ להתאים את התזמון של דגירה בהתבסס על משטרי ניסיוני ספציפיים על מנת להבטיח כי ניתן להשיג תוצאות אופטימליות.</li>
		<li>להעריך את הכדאיות תא mECap18 דרך היישום של וזמינותו הדרה סטנדרטי trypan blue28. למחוק את כל החומר שבו תא הכדאיות ירדה מתחת ל 90% כדי למנוע הטיה שהוצגו על ידי חלבונים שוחררו תאים מתים או הגוססת.</li>
		<li>לבודד חלבונים מ תא בינוני כדלקמן או לשמור על בינוני ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בידוד חלבון (אמור להתנהל בשכונה fume)<ol>
<li>להוסיף 20% נפח של חומצת חומץ טריכלור צוננת של 100% 80% בנפח בינוני תאים ממוזגים, כדי לזרז את החלבונים שוחרר מן התאים mECap18 בתרבית. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם ערבוב מתמיד.</li>
		<li>לאחר הדגירה, גלולה זירז חלבונים על ידי צנטריפוגה (17, 000 × g, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות). הערה: עקב כמות מוגבלת של חלבון צפוי להיות מופרש לתוך האמצעי, זה אפשרי כי בגדר לא להיות בקלות דמיינו לאחר צנטריפוגה. לכן, זה הכרחי כראוי להתמצא ברכבת התחתית לפני צנטריפוגה ולטפל שלא להפריע את המיקום צניפה ציפייה במהלך הסרת תגובת שיקוע.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את גלולה פעמיים עם אצטון צוננת לפני צנטריפוגה מחדש (17, 000 × g, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות).</li>
		<li>בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע לפני air-drying כל אצטון שיורית בתוך ברדס fume.</li>
		<li>Resuspend בגדר חלבון ב מאגר מיצוי מתאים כהכנה לניתוח הקצה לגילוי חלבון הפרשה מלאה פרופילים ו/או חלבונים היעד בודדים (למשל., מרחביות-דף, immunoblotting).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מחקרים אלה לשלב את השימוש של Bouin קבוע רקמת epididymal ולגופה פרפין הטבעה ופרוטוקולים סטנדרטיים אופטים. פתרון לשבועיים של Bouin כוללת תערובת של פורמלדהיד, חומצה picric, חומצה אצטית, עם כל רכיב יש פונקציה ספציפית ומשלימים. לפיכך, פורמלדהיד מגיב עם ראשי אמינים כדי ליצור חלבון חוצה קישורים, חומצה picric לאט ...

Spermatozoa של כל זני יונקים לרכוש את הפוטנציאל להצגת תנועתיות מתקדמת קדימה, כדי להפרות ביצית במהלך את התקדמותם. בכמאה ממושכת דרך יותרת האשך, אזור המערכת הגברי צינור במיוחד האשכים, אשר ייתכן מאוד מיוחדים 7-14 ימים כדי לנווט (תלוי בזן)1. בשל עיבוי קיצוני של כרומטין האבהי שפיכת הרוב המכריע של הציטופלסמה שמלווה את cytodifferentiation של spermatozoa בתוך האשכים, התפקודית עוקבות שלהם מונעת באופן בלעדי על ידי האינטראקציה שלהם עם microenvironment epididymal. סביבה זה, בתורו, נוצר על ידי הפעילות הפרשה ואת ספיגת ידע של סומה epididymal הבטנה ומציג רמה יוצאת דופן של קטע-קטע וריאציה1. כך, המקטעים הפעילים ביותר במונחים של סינתזת חלבונים והפרשת הם אלה הממוקמים בחלק הפרוקסימלית של יותרת האשך (כלומר, caput ו קורפוס)2. פעילות זו מראות לפרופיל תפקודי של spermatozoa, עם תחילת הראשונה תאים להצגת ההיכר של כשירות תפקודית (כלומר., תנועתיות מתקדמת ואת היכולת לאגד zona solubilized-חומצה glycoproteins) הבאים שלהם מעבר דרך יותרת האשך caput3. תכונות אלה פונקציונלי להמשיך לפתח לפני שהגיע רמות אופטימלית כמו הזרע להגיע דיסטלי epididymal המקטע (תסמונת), שבה הן מאוחסנות במצב של השבתה הדרגתית לקראת השפיכה. היווצרות ואת התחזוקה של מאגר אחסון זה הזרע קשורה באופן אינטימי גם האפיתל הציפוי, אשר תסמונת נשלטת על ידי פעילות ספיגת ידע חזק4,5. למרות הבדלים אנטומיים כבר דווח על6,7,8, כגון חלוקת העבודה שינגן מופיע להיות מאפיין של יותרת האשך שמשותף בין רוב זני יונקים למד עד כה, לרבות משלנו9,10. אכן, מנקודת מבט קליני, הוא מוכר שאת תפקוד epididymal גורם תרומה חשובה האטיולוגיה של גורם זכרי פוריות11, ובכך הדגשת החשיבות להבנת ברגולציה של רקמה מיוחדת זו.
לכן זה מצער כי ההבנה שלנו של פיזיולוגיה epididymal, ואת המנגנונים המווסתים את השלבים רציפים של זרע התבגרות ואחסון בתוך רקמה זו, יישארו לפתור באופן מלא. בין הגורמים התורמים, הגבלת ההתקדמות במחקר epididymal הם המורכבות הכוללת של רקמה זו וידע מנגנון רגולטורי לשלוט microenvironment luminal שלה. מבחינה אנטומית, אנו יודעים כי מעבר ההבחנה בין מקטעי caput, קורפוס, תסמונת, יותרת האשך נחלקים עוד מספר אזורי (איור 1 א'), אחד המופרדים באמצעות septa12 , המאופיינת פרופילים נפרדים של הגן/חלבון הביטוי13,14,15,16,17,18. ואכן, על בסיס נתונים היסטוריים תעתיק פרופיל של ביטוי גנים סגמנטלי של יותרת האשך, דווחו כ 6 ו 9 אזורים epididymal נפרדים במודלים עכבר, חולדה, בהתאמה19,20. כאלה המורכבות משקף ככל הנראה את ההרכב של סומה epididymal, אפיתל pseudostratified הכוללת סוגי תאים שונים רבים; כל שונות ביחס לפעילותם לשפע, הפצה, הפרשה/ספיגת ידע לאורך דרכי. כך, התאים העיקריים הם עד כה הנפוץ ביותר תא epididymal סוג המהוות למעלה מ- 80% של כל תאי אפיתל. בהתאם לכך, תאים עיקריים אחראים עיקר ביוסינטזה והפרשת חלבון epididymal5. לעומת זאת, האוכלוסייה התא ברורה לדרג כסוג התא השני הנפוץ ביותר בטווח סומה epididymal, מעורבים בעיקר סלקטיבית ספיגת רכיבי luminal, את לחומצי הזה microenvironment5. הוספת רמה נוספת של מורכבות, אנדרוגנים וגורמים אחרים lumicrine ממוצא האשכים להפעיל שליטה דיפרנציאלית על כל אחד מסוגי התאים epididymal בהתאם שלהם מיצוב לאורך מערכת.
למרות המגבלות שהוטלו על ידי כאלה המורכבות, התקדמות משמעותית ממשיכות להתבצע תוך פתרון הבסיס מכניסטית של פונקציה epididymal. מפתח מחקרים אלה כבר היישום של אסטרטגיות מתקדמות ספקטרומטר מסה כדי ליצור רשימות מלאי בהיקף נרחב של פרוטאום epididymal, במשולב עם ניתוח מפורט של חלבונים בודדים מתוך סקרים אלה הראשונית. איור של גישה זו הוא שלנו אפיון האחרונות של משפחת DNM mechanoenzymes העכבר דגם21. ההתעניינות DNM הראשונית שלנו הייתה מונעת על ידי פעילות כפולה צימוד של exo - ותהליכים endocytotic. בונים על תצפיות אלה, היינו מסוגלים להפגין כי שלושה איזופורמים הקנוני של DNM (DNM1 - DNM3) הם מאוד שבאה לידי ביטוי האשך העכבר וממוקמים כראוי כדי למלא את תפקידי רגולטוריות הפרשת חלבון וקליטה21 . יתר על כן, היינו יכולים להבחין בבירור כל isoform DNM על בסיס לוקליזציה הסלולר וסלולריות תת שלהם, ובכך רומז שיש ברשותם משלימים, לעומת פעילות עודפת, בתוך האפיתל epididymal21.
כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ניסיוני המועסקים לצורך המחקר של DNM ביטוי האשך עכבר עם תקווה כי מידע זה מצא יישום רחבות אפיון חלופי חלבונים epididymal, ובכך לתרום שלנו ההבנה של הפונקציה של יסוד חשוב זה של מערכת הרבייה הגברית. באופן ספציפי, אנו מתארים את פיתוח מתודולוגיה חזקים immunofluorescence תיוג של חלבונים היעד בסעיפים epididymal פרפין-מוטבע, זיהוי עוקבות של ההתפלגות המרחבי של חלבונים אלה באמצעות immunofluorescence מיקרוסקופ. בהמשך, ואנחנו מתעדים שלנו לאחרונה ממוטבת פרוטוקולים22 עבור בידוד ואפיון של epididymosomes; שלפוחית קטנה, כמו exosome מהווים רכיבי מפתח של הפרופיל הפרשה epididymal, מופיעים להחזיק תפקיד חשוב בקידום זרע התבגרות23. כמו בגישה המשלימה, אנו מתארים גם גילוי immunofluorescence של חלבונים היעד ב קו תא אפיתל epididymal (mECap18) caput מונצחים העכבר ושימוש של משאב זה כמודל שבה לחקור ברגולציה של epididymal הפרשה בפעילות חוץ גופית בתוך.

<table><tbody><tr><td>Dynamin 1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab108458</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Dynamin 2 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6400</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Dynamin 3 antibody</td><td>Proteintech</td><td>14737-1-AP</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>ATP6V1B1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21206</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>CD9 antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553758</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: monoclonal</td></tr><tr><td>Flotillin-1 antibody</td><td>Sigma</td><td>F1180</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>ALOX15 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab80221</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>TUBB antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5274</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Mouse, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: monoclonal</td></tr><tr><td>PSMD7 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11436</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11008</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11055</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Donkey, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11058</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Donkey, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11007</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rabbit HRP</td><td>Millipore</td><td>DC03L</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rat HRP</td><td>Millipore</td><td>DC01L</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Mouse HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>4&#039;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Thermo</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;alpha;-androstan-17&amp;beta;-ol-3-oneC-IIIN</td><td>Sigma</td><td>A8380</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Thermo</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Astral</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-gysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>78787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Ajax Finechem</td><td>A6-2.5 L GL</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly (vinyl alcohol)</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Ajax Finechem</td><td>783-500G</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Optima Max-XP</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuges</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Heracell</td><td>150</td><td></td></tr><tr><td>Large Orbital Shaker</td><td>Ratek</td><td>OM7</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>LG</td><td>MS3840SR /00</td><td></td></tr><tr><td>Lab pH Meter</td><td>MeterLab</td><td>PHM220</td><td></td></tr><tr><td>Liquid-repellent slide marker</td><td>Daido Sangyo</td><td>Mini</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo</td><td>586</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>CELLSTAR</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Mikro-Glass</td><td>SF41296PLMK</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m filter</td><td>Millox-HV</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Dustfree Paper</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 &amp;times; 35 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>347356</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 &amp;times; 56 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;micro;m Nylon</td><td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 &amp;times; 10 mm with cams</td><td>SARSTED</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Slide jar</td><td>TRAJAN</td><td>#23 319 00</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of epididymal protein synthesis and secretion

יותרת האשך בתרבית של מפיק אחד הנוזלים intraluminal המורכבים ביותר של כל בלוטה אנדוקרינית על מנת לתמוך את ההבשלה פוסט-האשכים ואחסון של spermatozoa. המורכבות כזה מתעוררת עקב הפעילות הפרשה ואת ספיגת ידע משולב של תאי אפיתל רירית. כאן, אנו מתארים את הטכניקות לניתוח של סינתזת חלבונים epididymal והפרשת על-ידי התמקדות משפחת חלבונים המודל של dynamin (DNM) mechanoenzymes; GTPases גדולים שיש להם פוטנציאל להסדיר אירועים סחר ממברנה דו כיווני. לצורך המחקר של ביטוי חלבונים ברקמת epididymal, נתאר מתודולוגיה חזקים immunofluorescence תיוג של חלבונים היעד בסעיפים פרפין-מוטבע, זיהוי עוקבות של ההתפלגות המרחבי של חלבונים אלה באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. אנו מתארים גם מתודולוגיה אופטימיזציה בידוד ואפיון של exosome כמו שלפוחית, הידועה בשם epididymosomes, אשר מופרשים לתוך לומן epididymal להשתתף בתקשורת המערכת עם התבגרות תאי זרע. כמו בגישה המשלימה, נתאר גם גילוי immunofluorescence של חלבונים היעד בתור תא העכבר מונצחים SV40 caput epididymal אפיתל (mECap18). יתר על כן, נדון בכלי השירות של שורת תאים mECap18 כדגם מתאים במבחנה בה לחקור את ויסות פעילות הפרשה epididymal. לענין זה, אנו מתארים את הדרישות culturing עבור התחזוקה של הקו תא mECap18 ושימוש של משטרי עיכוב תרופתי סלקטיבית כי הם מסוגלים להשפיע על הפרופיל שלהם חלבון הפרשה. האחרון הם העריכו בקלות באמצעות קציר של בינוני תרבות ממוזגים, ריכוז חלבונים המופרש בעזרת חומצת חומץ טריכלור/אצטון משקעים וניתוח עוקבות שלהם דרך מרחביות-דף ו- immunoblotting. אנו טוענים כי שיטות אלה משולבים מתאימים לניתוח של חלבון epididymal חלופי מטרות כהקדמה קביעת שלהם תפקיד פונקציונלי זרע התבגרות ו/או אחסון.

איור 1 ו איור 2 הצג תוצאות נציג של immunofluorescence לוקליזציה של DNM האשך caput העכבר. כל אחד שלושה איזופורמים DNM חקר פרופילים נפרדים לוקליזציה התצוגה. לפיכך, DNM1 מאופיין על ידי תיוג ' מאטום לשקוף ' צנוע יחסית של תאי epididymal במהלך האשך פלח ואת caput ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion at JoVE.com

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

כאן, אנו מדווחים על לוקליזציה immunofluorescence של dynamin כדי להמחיש את הפרוטוקולים עבור זיהוי חלבונים בסעיפים epididymal העכבר פרפין-מוטבע ואלו של קו מונצחים תא epididymal (mECap18). אנו מתארים גם את הפרוטוקולים עבור הבידוד של חלבונים הפרשה של נוזל epididymal והן תאים ממוזגים מדיה.

ניתוח של סינתזת חלבונים Epididymal והפרשת

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

analysis-of-epididymal-protein-synthesis-and-secretion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K Views.  University of Newcastle. כאן, אנו מדווחים על לוקליזציה immunofluorescence של dynamin כדי להמחיש את הפרוטוקולים עבור זיהוי חלבונים בסעיפים epididymal העכבר פרפין-מוטבע ואלו של קו מונצחים תא epididymal (mECap18). אנו מתארים גם את הפרוטוקולים עבור הבידוד של חלבונים הפרשה של נוזל epididymal והן תאים ממוזגים מדיה.

Video: Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biochemistry

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Biology

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Medicine

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

ניתוח Phosphopeptide של מכרסמים epididymal תאים-זרע

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...