גישות פרוטאומיות ממוקדות הופכות במהירות לשיטת הבחירה לאימות חלבונים מניסויים מבוססי פרוטאומיה לטווח קצר או מניסויים מבוססי ביולוגיה מולקולרית. ניטור תגובה מרובה הוא גישה ממוקדת אחת כזו אשר משמש יותר ויותר כדי לזהות ולכומת חלבונים מדגימות ביולוגיות. במחקר זה עברנו על השלבים השונים הכרוכים באיתור וכימות חלבונים מרקמת המוח האנושית מתוך כוונה להציג לקוראים את הדרישות הבסיסיות של ניסוי MRM.
שקול סביב 50 מ"ג של רקמת המוח, ולשטוף את הרקמה עם 300 microliters של תמיסת מלח פוספט 1x חוצץ. שלב זה מבוצע כדי להסיר כל דם על פני השטח החיצוניים של הרקמה, ולכן מומלץ להסיר דם רב ככל האפשר. לאחר שטיפות עם PBS, להוסיף 300 microliters של חוצץ תמוז לצינור המכיל את הרקמה.
ללקק את הרקמה באמצעות sonicator בדיקה תוך שמירה על הצינור על אמבט קרח. המשך עם הומוגניזציה רקמות באמצעות מקצף חרוזים כדי לגמרי לייס את הרקמה. צנטריפוגות את התוכן של הצינור ב 6000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
מעבירים את הסופר-נט לצינור טרי ומערבבים בצורה הומוגנית. קחו אליקוט קטן של הסופר-נט, וכימתו את תכולת החלבון באמצעות מבחון חלבון סטנדרטי. כאן אנו מראים דוגמה להערכת חלבונים באמצעות ברדפורד אסאי.
קח 50 מיקרוגרם של חלבון בצינור microcentrifuge ולהפחית את התוכן על ידי הוספת TCEP כך הריכוז הסופי הוא 20 מילימולר. לדגור על התוכן ב 37 מעלות במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, alkylate חלבונים מופחתים על ידי הוספת iodoacetamide לצינור, כך הריכוז הסופי הוא 40 מילימולר.
לדגור על הצינור בחושך במשך 30 דקות. עכשיו להוסיף Buffer B לצינור הכיל חלבונים מופחתים אלקילאטים, כך הריכוז הסופי של אוריאה הוא פחות טוחנת אחת. הוסיפו טריפסין ב-1 עד ליחס של 30 אנזימים לחלבון ודגרו את הצינורות למשך הלילה ב-37 מעלות עם רעידות בלתי פוסקות.
לאחר העיכול, לרכז את הפפטידים מעוכלים ברכז ואקום. בשלב זה, הפפטידים יכולים להיות משוחזרים ומותפלים או מאוחסנים במינוס 80 לשימוש עתידי. התפלה, או ניקוי פפטיד, חיוני לפני טעינת הדגימות על כל LC-MS MS. מלחים ומזהמים אחרים במדגם יכולים לסתום את העמודה ולהשפיע על הרגישות של המכשיר בטווח הארוך.
ניתן לבצע תהליך זה באמצעות עצות או עמודות C18 STAGE הזמינות מסחרית. כאן תיארנו את זרימת העבודה להתפלת פפטיד באמצעות טיפ C18 STAGE. לאחר התפלה, יבשו את הפפטידים ברכז ואקום.
תרכיב מחדש פפטידים נקיים אלה והמשיך לכימות בשיטת Scopes. בשביל זה, לטעון שני microliters של המדגם בצלחת microdrop ולחשב את הריכוז כפי שמוצג בשקופית. הכנת רשימת מעבר היא שלב מכריע בניסוי SRM או MRM.
רשימת מעבר מכילה את כל המידע הנדרש על-ידי ספקטרומטר המסה כדי לפקח על המעבר. זה כולל את ערכי m על ידי z של המבשר ויוני המוצר, אנרגיית התנגשות של המעבר, הקוטביות של המכשיר וטווח הזמן לרכישת נתונים. הכן את רשימת המעבר באמצעות קו הרקיע.
הכן פרוטאום רקע באמצעות קובץ Human Proteome Fasta מ- UniProt וודא שהוא נבחר תחת הכרטיסיה רקע של הגדרות פפטיד. בכרטיסיה סינון, הגדר אורך מינימלי של 8 ואורך מרבי של 25. המשך להשתמש בהגדרות ברירת המחדל אם אין שינויים אחרים בפפטידים.
לאחר שהגדרות הפפטיד נוצרו, לחץ על הגדרות מעבר. תחת הכרטיסיה סינון, הגדר חיובים קודמים כ- 2 ו- 3. הגדר את חיובי Ion כ- 1 והגדר סוגי יונים כ- y.
ניתן לבחור יונים של מוצרים בהתאם לבחירת המשתמש. השאר את כל הפרמטרים כברירת מחדל. כעת הכנס את מזהי הגישה של חלבוני היעד שנבחרו.
ניתן לעשות זאת על-ידי לחיצה על הכרטיסיה עריכה ולאחר מכן בחירה באפשרות הוספה והדבקה סופית של מזהי הגישה. מזהים יפופו לחלבונים שבפרקע ורשימת מעבר שנוצרה בהתבסס על הגדרות הפפטיד והמעבר שנקבעו קודם לכן. יצא רשימת מעבר זו.
ודא שהכלי הנכון נבחר על-ידי לחיצה על האפשרות הנפתחת סוג כלי. במקרה זה, המכשיר הוא תרמו אלטיס. מאחר שרשימת המעברים הלא מוגדרת כוללת מעברים רבים מדי, שמור על מגבלה של 350 מעברים בלבד לכל רשימה וייצוא כשיטות מרובות.
נעשה שימוש במערכת ממס בינארית. ממס A הוא 1%FA וממס B הוא 80%ACN. שמור על קצב הזרימה על 450 מיקרוליטר לדקה ואת מעבר הצבע כפי שמוצג.
הגדר טמפרטורת תא עמודה ב 45 מעלות צלזיוס. לקבלת פרטים נוספים אודות מערכת עמודות ו- LC, עיין בטקסט. ודא שהגדרות MS ב- TSQ Altis שלך כפי שמוצג כאן.
יבא רשימת מעבר בודדת כדי ליצור שיטה חדשה. אנו מציעים לשמור על הרזולוציה לרביעייה 1 ורביעייה 3 ב-7. אלה יכולים להיות ממוטבים עוד יותר במידת הצורך.
כדי להבטיח עקביות בריצות וכתוצאה מכך את איכות הנתונים, הכן את רצף הריצה שלך כפי שמוצג. התחל עם כמה ריקים, עיין בטקסט להרכב של תערובת ריקה, ואחריו BSA אור סטנדרטי QC של ריכוז ידוע כדי לפקח על כל וריאציה בתגובה היומית של המכשיר. QC עשה צריך להיות ממש לפני הדגימות.
הבא בשורה את כל הדגימות עם כדורי סרק באמצע. הזרקת נפחים שווים של כל מדגם, חשבונאות 25 עד 1 ננוגרם של פפטידים לכל זריקה. כדי ליצור שיטה מעודנת, הפעל תחילה את השיטות הלא מוגדרות נגד דגימות שלמות.
יש לייבא תוצאות לתוך סקייליין ולבדוק ידנית כל פפטיד. עבור כל פפטיד, בחר הקדמה אחת המציגה פסגות טובות בעקביות בכל הדגימות. מחק מבשרי פפטידים שאינם מציגים פסגות טובות.
ודא שכל הפסגות מובאות כראוי. כדי לבחור את הפסגה הנכונה ולמקד עוד יותר את המעברים תחת כל מבשר, ניתן להשתמש בספריה. ספריה היא קבוצה של נתונים ספקטרליים של MS-MS המותאמים לפפטידים ומעברים של הנתונים הניסיוניים הנוכחיים.
בחר פסגות שערכי DART P קרובים יותר ל- 1 והסר מעברים שאינם תואמים לספריה. ערך DART P מציין עד כמה ההתאמה טובה בין השיא הניסיוני לשיא הספריה. לאחר סבב מיטוב אחד או שניים, רשימה מעודנת תהיה מוכנה.
ניתן להפעיל רשימה מעודנת זו עבור דוגמאות בודדות. יבא את הריצות המעודנות לקו הרקיע וביאורים פסגות כראוי. השתמש בכרטיסיה ביאור תחת הגדרות מסמך כדי לבאר כל דוגמה ברשת המסמך בקפידה.
השתמש בתכונה 'השוואת קבוצה' כדי ליצור השוואות בין תנאי 1 למצב 2 של הניסוי שלך. פעולה זו תעניק טבלה עם ערכי P מותאמים ותקפל ערכי שינוי בין שתי הקבוצות. למיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון המשתמש ב- MRM כדי לזהות פפטידים לחלבונים Apolipoprotein A-1, Vimentin, ו Nicotinamide זרחן זרחן בדגימות רקמת המוח האנושית.
מיטוב פרמטרים שונים כגון שיפוע LC, זמן השתהות, זמן מחזור ואנרגיית התנגשות יכול להשפיע מאוד על ההצלחה של ניסוי MRM. אנו מאמינים כי טכניקה זו יכולה לשמש לפיתוח דפוסים של סמנים ביולוגיים עם יכולת להבחין בין תנאים קליניים שונים ומחלות.
